lunes, 3 de enero de 2011

Métodos de Clasificación de Levaduras


CARACTERÍSTICAS UTILIZADAS EN LA CLASIFICACIÓN DE LEVADURAS
- Aspecto microscópico de las células.
- Modo de reproducción sexual.
- Características fisiológicas (especialmente nutricionales).
- Características bioquímicas.
- Comparación de genomas por reasociación de DNA-DNA ó DNA-RNA

Taxonomia: Estudio de clasificación e identificación.
Clasificación: Agrupamiento de organismos en un taxa (taxón) de acuerdo con sus similitudes o relaciones ancestrales o ambas cosas.
Identificación: Comparación entre una cepa desconocida y otra similar conocida.
Nomenclatura: El nombre de un taxa aceptado.

ASPECTO MICROSCÓPICO
Tamaño de las células.
Forma: La forma de las células indica el modo de reproducción vegetativa.
Formación de filamentos
Reproducción sexual. Estructura y forma de ascosporas y teliosporas

CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS
Capacidad de fermentar ciertos azúcares (test de fermentación).
Crecimiento aeróbico con diversos compuestos (tests de asimilación)cada uno como única fuente de carbono o nitrógeno.
Escisión de arbutina.

CARACTERÍSTICAS TECNOLÓGICAS
Estudio del poder fermentativo.
La temperatura de incubación para los tests de taxonomía es de 25º C, aunque el óptimo para unas levaduras es mas alto y para otras mas bajo.

METODOS DE CLASIFICACIÓN DE LEVADURAS

ESPORIFICACIÓN

Método: La esporulación se provoca por cultivo de las levaduras en un medio favorable (medio de preesporulación), rico en glucosa, en el que permanecen un período de 48 horas a 28°C de temperatura. Transcurrido este tiempo, se siembran en un medio de esporulación (medio de esporifícación) pobre en glucosa, con el fin de reducir en lo posible la reproducción vegetativa, y complementado con una sustancia inductora de la esporulación como es el acetato. En este último medio se mantendrán por espacio de 3 a 5 días a una temperatura de 25°C. Pasado este período de incubación, se hacen preparaciones en fresco seguidas de observación microscópica, anotándose la presencia o ausencia de esporas así como su tamaño. Para facilitar dicha observación puede hacerse tinción de esporas en los casos dudosos.

En los casos de esporulación negativa los cultivos se mantendrán a temperatura ambiente examinándose semanalmente durante un mínimo de 4 a 6 semanas.

Composición de los medios:

Medio de preesporulación
Glucosa 50 g
Extracto de levadura 10 g
Nutrient-Broth (Difco) 30 g
Acetato potásico
Agar 20 g
Agua 1000 ml

Medio de esporifícación:
Glucosa 1 g
Extracto de levadura 2,5 g
Nutrient-Broth (Difco)
Acetato potásico 9,8 g
Agar 20 g
Agua 1000 ml

Antes de entubar debe fundirse el medio ya que contiene agar.
La esterilización de los medios se realiza en autoclave, una atmósfera durante 15 minutos.

PODER FERMENTATIVO

El poder fermentativo es la medida del porcentaje (V/V) de etanol, que una cepa de levadura es capaz de producir.

Esta prueba fue originalmente ideada por Hayduck y descrita por Hericstoth y Osztrovsky en 1927. Se basa en la determinación, por perdida de peso, del anhídrido carbónico que se desprende durante la fermentación alcohólica, según la ecuación estequiométrica:
C2H12 06 ——-———— 2 CO2 + 2 CH3-CH2OH

Método: Para la determinación del poder fermentativo, se prepara mosto de uva de 12º Beaumé a partir de mosto concentrado, ajustando el pH a 5 con soluciones de hidróxido sódico o de ácido clorhídrico.

El medio así preparado, se reparte en matraces erlenmeyer de 100 ml. de capacidad, poniendo 50 ml de medio en cada uno. Se esterilizan en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

La siembra se realiza con asa de platino a partir de cultivos jóvenes-, una vez sembrado el mosto, los matraces se cierran con tapones de goma provistos de válvulas Müller con acido sulfúrico concentrado. Estas válvulas permiten la salida del anhídrido carbónico e impiden la entrada de aire.

Finalizada la siembra se pesan los matraces y se llevan a incubar a 25°C. hasta peso constante.

La diferencia de peso resultante al final del proceso indicará el anhídrido carbónico desprendido, que multiplicado por un factor establecido da directamente el valor de etanol formado en tanto por ciento (V/V).

Cálculo del factor:
Al fermentar 180 g de glucosa producen 88 g de anhídrido carbónico y 92 de etanol; por tanto a un gramo de CO2 le corresponde 1,04 g de etanol. Siendo la densidad del etanol de 0,79, a los 1,04 g le corresponde un volumen de 1,3 ce Por consiguiente 1 g de CO2 se corresponde con 1,3 ce de etanol.

La diferencia de peso en gramos multiplicada por 1,3 da el volumen de etanol producido.

Volumen de mosto———————— 1,3 x pérdida de peso = g de etanol
100 ———————————————— PF

El volumen de mosto era de 50 ml. luego:
PF = 100 x 1,3 x perdida de peso en gramos : 50
P.F. = 2,6 x pérdida de peso en gramos.

En la práctica se multiplica por 2,5 ya que el rendimiento no es del 100.

El resultado de esta prueba proporciona un dato orientativo importante sobre la identidad de la cepa objeto de estudio.

Los taxónomos no consideran esta prueba, sin embargo en el Instituto de Fermentaciones Industriales, se ha observado que esta prueba determina de forma rápida el género y dentro de él, en algunos casos del género Saccharomyces permite distinguir entre especies distintas. La no inclusión de esta prueba puede ser debida a que el mosto de uva no es mayoritariamente la fuente de estudio de levaduras como sucede en este Instituto casi desde sus orígenes.

FORMACIÓN DE RAMIFICACIONES PSEUDOMICELIARES

Método: En una placa Petri se coloca un papel absorbente y encima una varilla de vidrio acodada sobre la cual se deposita un portaobjetos. El conjunto se esteriliza en estufa a 120Cº de temperatura durante 3 horas. Una vez estéril y trabajando en condiciones asépticas, sobre el porta se aplican unas gotas de agar-malta fundido y estéril, para formar una fina película. Cuando el medio está sólido, se siembra a partir de cultivo joven (de 48 horas en agar-malta) con hilo de platino, haciendo una estría longitudinal y varias transversales muy ligeras. Sobre el papel se vierte agua estéril con el fin de mantener un alto grado de humedad dentro de la placa.

Las posibles ramificaciones se pueden detectar por observación directa al microscopio tras la incubación a 25C de temperatura a los 15 y 30 días a partir de la siembra. Pueden observarse formaciones como clamidosporas, blastosporas y artrosporas. La importancia de esta prueba es mayor en el caso de cepas que no presentan esporas.

Dependiendo de la forma y disposición de las blastosporas pueden distinguirse varios tipos de pseudomicelio:

- Tipo micándida. Con blastosporas redondas o alargadas, y más o menos ramificadas.
- Tipo micotórula. Con blastosporas redondas y con disposición axial en los verticilos, aparentando racimos de células redondas.
- Tipo blastodendrium. Con blastosporas alargadas y ramificadas en los verticilos.

FORMACIÓN DEL VELO

La propiedad de formar velo sobre medio líquido aparece en numerosas especies de levaduras.

Aunque la formación de velo parece estar estrechamente relacionada con el requerimiento de oxígeno por parte de la levadura, las levaduras fermentativas pueden formar velo al igual que las no fermentativas. Si bien, factores tales como composición del medio, formas del recipiente, edad, cantidad de inoculo son de importancia en su formación.

El valor taxonómico de esta prueba no es importante pero constituye un dato más en la caracterización de la especie.

Método: Para el estudio de la formación de velo, se siembra la levadura en mosto de uva de 8° Baume.

Se prepara mosto de uva de 8° Baumé, diluyendo en agua destilada un mosto de uva concentrado de buena calidad, o bien obtenido de uva fresca. se calienta a ebullición y se filtra en caliente con filtro de jarabe, ajustándose después el pH a 5. Se deja enfriar y se filtra mediante un filtro de jarabe.

Se reparten 10 ml en cada uno de los tubos de ensayo de 16 x 160 mm.

Nuevamente se esteriliza en el autoclave, a media atmósfera durante 30 minutos. De esta forma tenemos un mosto claro y estéril, preparado para la siembra.

Dicha siembra se efectúa pasando un asa de cada cultivo joven, de 48 horas, a un tubo de mosto de uva, realizando esta operación por duplicado.

El medio inoculado se mantiene durante un mes a la temperatura de 21° C ± 1.

La primera observación se lleva á cabo a los dos días de la siembra.

Se anotan los resultados de la siguiente manera:
Presencia de velo con el signo V.
Presencia de islotes con el signo I.
Presencia de anillo con el signo A.
Ausencia de velo con el signo VN.
El signo S se reserva para los casos en que se aprecia sedimento de la levadura en el mosto, y el T, para los que se aprecia fuerte turbiedad y desprendimiento de burbujas.

FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

La capacidad de las levaduras para fermentar azúcares, se observa por cultivo de las cepas en estudio en soluciones líquidas de los azúcares a ensayar.

La composición de los medios utilizados es la siguiente:
Bacto-Yeast-Nitrogen-Base (Difco) 6,7 g
Azúcar a examen 20 g
Agua destilada 1000 ml

Método: Preparados los medios se distribuyen en tubos de ensayo a razón de 9 ml por tubo, provistos de campana Durham; y se esterilizan en autoclave a 121C (una atmósfera) durante 15 minutos. La siembra se realiza a partir de cultivos jóvenes (de 48 horas en agarmalta), se incuban en estufa a 28Cº durante 15 días. La prueba se considera positiva si aparece gas en la campana, después de la incubación.

Los azúcares ensayados son: glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa, lactosa y rafinosa.

Merece atención especial el caso de la rafinosa. Los medios correspondientes a cepas que dan resultado positivo en la fermentación de este azúcar, se someten a cromatografía de papel con el fin de averiguar cual es el compuesto que, tras la ruptura de la rafinosa queda libre en el medio.

Tras la cromatografía se pueden dar tres casos:
- Queda libre melibiosa o sacarosa Fermentación 1/3
- Queda libre galactosa Fermentación 2/3
- No aparecen restos de ningún azúcar Fermentación 3/3

ASIMILACIÓN DE AZÚCARES

La asimilación de azúcares consiste en determinar los azúcares que pueden metabolizar por vía oxidativa las cepas de levadura en estudio. Dado que todo azúcar fermentado es también asimilado, esta prueba solo se realiza con aquellos azúcares a los que la cepa no ha fermentado.

La composición de los medios utilizados es la siguiente:
Bacto-Yeast-Nitrogen-Base (Difco) 6,7 g
Azúcar a examen 1 g
Agar 20 g
Agua destilada 1000 ml

La siembra se realiza partiendo de cultivo joven (de 48 horas en agar-malta), suspendido en suero fisiológico. El contenido de esta suspensión se vierte sobre los tubos con los medios inclinados de los azúcares en estudio, de tal forma que toda la superficie del medio quede impregnada del inóculo, para después desechar la suspensión sobrante. Sembrados así los tubos, se incuban a 28Cº durante 15 días, al cabo de los cuales, la existencia de crecimiento sobre la superficie del medio indica respuesta positiva, mientras que su ausencia se considera negativa.

Otra forma de realizar esta prueba consiste en utilizar el método auxonográfico. Este método se realiza en placas y en cada una de ellas pueden hacerse a la vez las pruebas de varios azúcares.

El medio utilizado es:
Bacto-Yeast-Nitrogen-Base (Difco) 6,7 g
Agar 20 g
Agua destilada 1000 ml

Se esteriliza en autoclave a 121Cº durante 15 minutos, después se deja enfriar hasta 45Cº y se reparte en las placas, en las cuales previamente se ha puesto una suspensión en solución fisiológica de las cepas a estudiar, se agita para homogeneizar y se deja solidificar. Sobre el medio inoculado se colocan discos de papel absorbente impregnados en soluciones estériles de los azúcares a examinar al 2% en agua destilada. Las placas se incuban a 28Cº durante 3-4 días, observándose entonces si se han producido halos de crecimiento, en cuyo caso la prueba se considera positiva.

ASIMILACIÓN DE NITRATOS

Es la prueba de utilización de nitratos de forma aerobia como fuente de nitrógeno por parte de las levaduras.

Los dos medios utilizados en esta prueba tienen la siguiente composición:

Medio 1
Yeast-Carbon-Base (Difco) 11,7 g
Nitrato potásico 0,78 g
Agar 20 g
Agua destilada 1000 ml

Medio 2
Yeast-Carbon-Base (Difco) 11,7 g
Agar 20 g
Agua destilada 1000 ml

Método: La siembra en ambos casos se realiza por el método indirecto, partiendo de cultivo joven (de 48 horas en agarmalta), suspendido en suero fisiológico. El contenido de esta suspensión se vierte sobre los tubos con los medios inclinados en estudio, de tal forma que toda la superficie del medio quede impregnada del inóculo, para después desechar la suspensión sobrante. Una vez sembrados, los tubos se incuban durante 15 días a 28ºC. Transcurrido este tiempo se compara cada uno de los cultivos pertenecientes al mismo microorganismo, observándose si la presencia de nitrato potásico ha facilitado o no el crecimiento de la cepa sembrada. En el caso de que el crecimiento sea mayor en el medio que contiene nitrato que en al que carece de él, se considera positivo el resultado. Cuando no se aprecia diferencia se anota como negativo, pues se considera nula la influencia del nitrato.

ESCISIÓN DE LA ARBUTINA

La rotura de la arbutina es una prueba de confirmación de la actividad de ß-glucosidasa en las cepas de levadura.

El medio utilizado tiene la siguiente composición:
Arbutina 5 g
Extracto de levadura 1 g
Agar 20 g
Agua destilada 1000 ml

Método: Una vez disuelto el medio al Baño María, se distribuye en tubos de ensayo a los que previamente se les ha añadido una gota de sal férrica soluble (cloruro férrico al 1% en agua destilada). Se esterilizan en autoclave a 121Cº durante 15 minutos y después se inclinan para su solidificación.

La siembra se realiza por estría a partir de cultivos jóvenes, incubándose en estufa a 28Cº durante 15 días. Es conveniente dejar un tubo sin sembrar en las mismas condiciones para que actúe como testigo.

La prueba se considera positiva cuando se aprecia una cambio de color con respecto al tubo testigo tras el crecimiento de la levadura, ya que en los casos en que se hidrolice la arbutina se produce una quinona libre que al reaccionar con la sal férrica soluble presente en el medio da una coloración pardo-oscura.

MÉTODOS MOLECULARES

Son técnicas moleculares, basadas en el análisis de fragmentos de las moléculas de ácidos nucleicos, siendo las más utilizadas la electroforesis de cariotipo, el análisis de microsatélites, el polimorfismo de longitud del DNA mitocondrial, el polimorfismo longitudinal de los fragmentos de restricción del RNA ribosomal, el polimorfismo del DNA amplificado aleatoriamente y el análisis de los RNA de bajo peso molecular.

Los métodos moleculares de identificación de levaduras y microorganismos en general, se basan en el estudio de las moléculas de DNA y RNA.

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