domingo, 4 de diciembre de 2011

Los Compuestos Fenólicos y sus Métodos de Análisis


LOS COMPUETOS FENÓLICOS Y SUS MÉTODOS DE ANÁLISIS

Los compuestos fenólicos se caracterizan por tener un núcleo bencénico con uno o varios grupos hidroxilo, pudiendo clasificarse entre los compuestos no flavonoides: ácidos fenoles y sus derivados; y los compuestos flavonoides: flavonoides propiamente dichos, antocianos, y taninos, todos ellos de 15 átomos de carbono con una estructura: C6 – C3 – C6.

En general, los compuestos no flavonoides se localizan en todas las partes del racimo, especialmente en la pulpa, mientras que los flavonoides lo hacen en las pepitas, hollejos y raspones.

En las elaboraciones en tinto, los polifenoles de la uva pasan por la maceración en un 60 % del contenido total en la uva, y dentro de éstos los antocianos pasan en un 40 % y los taninos en un 20 %; siendo los antocianos extraídos rápidamente, mientras que los taninos lo hacen más lentamente, por ser solubilizados en presencia de alcohol y temperatura. En las elaboraciones en blanco, el paso de ácidos fenoles caftárico y cutárico, son respectivamente del 40 % y 20 % respecto de lo contenido en la vendimia; pudiendo en una maceración pelicular prefermentativa incrementarse estas sustancias en un 20 % más, así como los taninos monómeros y dímeros multiplicarse por tres.

La medición de los polifenoles totales de los vinos se puede hacer por tres métodos: índice de permanganato, índice de Folin-Cicalteu, y el índice de DO 280. El índice de Folin-Ciocalteau consiste en medir la absorbancia a 760 nm al cabo de media hora, un mililitro de vino diluido 1 / 5 o 1 /10 según su intensidad de color, 5 ml de reactivo Folin – Ciocalteu, 20 ml de carbonato sódico al 20 %, y enrasando con agua destilada hasta 100 ml.

IFC = A760 x Factor de dilución x 20

El factor 20 se utiliza para lograr resultados comparables con los del índice D280. Los resultados también se pueden expresar en mg de ácido gálico, mediante la interpolación de una recta de calibrado.

ACIDOS FENOLES Y SUS DERIVADOS

Los ácidos fenoles se dividen en dos grupos: los ácidos benzoicos de estructura C6 – C1, y los ácidos cinámicos de estructura C6 – C3, encontrándose en concentraciones de 10 a 20 mg / litro en los vinos blancos y de 100 a 200 mg / litro en los vinos tintos. Estos ácidos se pueden encontrar en el vino en forma libre, procediendo de la hidrólisis de otros polifenoles, especialmente de los antocianos, que se degradan en presencia de oxígeno y calor, lo que supone un mecanismo de la destrucción del color; o bien pueden encontrarse en forma combinada, parcialmente esterificados especialmente con el ácido tartárico o ácidos hidroxicinámicos, destacando entre ellos: ácido cafeoil tartárico o caftárico, ácido p-cumaroil tartárico o cutárico, y el ácido feruloil tartárico o fertárico; procediendo estos últimos de la uva, estando contenidos en las vacuolas de las células del hollejo y la pulpa, en una proporción de 2 a 100 veces mayor respectivamente. Estos ácidos son específicos de la Vitis vinífera respecto del resto de frutas, y sus contenidos varían en el hollejo de 0,06 a 0,80 mg / gramo para el ácido caftárico, de 0,30 mg / gramo para el ácido cutárico, y menos de 0,01 mg / gramo para el ácido fertárico. En cuanto a los ácidos benzoicos, el más abundante en la uva es el ácido gálico bajo la forma de éster de flavanoles.

Los ácidos fenoles son incoloros, inodoros e insípidos, aunque con el tiempo y la oxidación pueden tornarse de color amarillo; así como también, bajo la acción de algunos microorganismos, pueden transformarse en fenoles volátiles, que presentan olores muy característicos y a veces defectuosos:

Vinos tintos: Etil-4-fenol     (Animal, sudor de caballo) 720 μg / litro;  Etil-4-guayacol     (Ahumado, especiado) 420 μg / litro.

Vinos blancos:    Vinil-4-fenol (Especido, pimienta) 720 μg / litro; Vinil-4-guayacol (Ahumado, farmacia) 420 μg / litro.

En los vinos blancos la relación existente entre el vinil-4-fenol / vinil-4-guayacol oscila entre 1 / 1 a 3 / 1, mientras que en los vinos tintos, la relación entre el etil-4-fenol / etil-4-guayacol es del orden de 8 / 1. En los primeros estas sustancias proceden de la descarboxilación enzimática de los ácidos cinámicos del mosto: ácido cumárico y ácido ferúlico; realizada por una enzima formada por las levaduras en fermentación alcohólica, llamada “cianamato descarboxilasa (CD)” específica de estas sustancias, y que es inhibida por la presencia de polifenoles, razón por la cual estos compuestos no se encuentran en los vinos tintos. Algunas levaduras secas activas (LSA) son seleccionadas por su bajo poder cianamato descarboxilasa, siendo denominadas como levaduras POF (phenolic off flavor) de gran interés en la elaboración de los vinos blancos.

Otros factores que influyen en la formación de estas sustancias, son las vendimias muy maduras, los desfangados deficientes, la maceración pelicular del mosto con los hollejos, la oxidación de los mostos que actúan sobre los ácidos fenoles, y sobre todo determinadas enzimas pectolíticas comerciales derivadas del Aspergillus niger, que poseen una actividad enzimática “cianamato esterasa (CE)”, formando a partir de los ácidos cinámicos esterificados los ácidos correspondientes; los cuales pueden ser transformados en vinil-4-fenol y vinil-4-guayacol, por las levaduras con poder cianamato descarboxilasa. Esta actividad solamente se presenta en el mosto, pues la cianamato esterasa se inhibe en presencia del etanol durante la fermentación alcohólica.

En los vinos tintos se pueden formar los fenoles volátiles: etil-4-fenol y etil-4-guayacol a partir de los ácidos cumárico y ferúlico, apareciendo en primer lugar los correspondientes vinil-4-fenol y vinil-4-guayacol por las levaduras durante la fermentación alcohólica, mediante la intervención de la enzima cianamato descarboxilasa (CD), y posteriormente durante la crianza en barrica, cuando por falta de atención o de higiene se desarrollan las levaduras Brettanomyces / Dekkera antes citadas, y donde interviene la enzima “vinil-fenol reductasa (VFR)”. En ocasiones estos compuestos se pueden formar directamente durante la fermentación alcohólica, o bien durante la fermentación maloláctica por algunas bacterias lácticas como: Peddiococcus pentasaceus, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus brevis; pero en cualquier caso, siempre de menor actividad que con las levaduras Brettanomyces.

Otros compuestos fenólicos contenidos en la vendimia son los estilbenos, entre los que destaca el resveratrol o 3,5,4´-trihidroxi-estilbeno, que se encuentra en el hollejo de la uva en una concentración aproximada de 20 μgramos / gramo de materia fresca o en las pepitas de 43 μgramos / gramo, dependiendo del estado sanitario de la vendimia, pues se desarrolla cuando se produce una ataque fúngico y como respuesta de la vid a esa agresión. Sobre todo se encuentra en vinos tintos, en concentraciones de hasta 10 mg / litro, presentando unas interesantes propiedades higiénicas o sanitarias para el consumo humano.

Durante la fermentación alcohólica también se pueden formar otros compuestos fenólicos, como el tirosol (alcohol p-hidroxi-fenil-etílico) procedente de la tirosina y en concentraciones de 20 a 30 mg / litro, conservándose durante la crianza, y acompañado de otros alcoholes no fenólicos como: triptofol (0,1 a 1,0 mg / litro) y alcohol fenil-etílico (10 a 70 mg / litro).

Por último, procedentes de la madera durante la crianza, pueden aparecer en los vinos otras sustancias fenólicas como las cumarinas, derivadas de los ácidos cinámicos del roble, y agrupadas de la siguiente forma:

Forma glicosilada: Aesculina (Madera verde. Sabor amargo. Escopolina)

Forma aglicona: Aesculetina (Madera secada natural. Sabor ácido. Escopoletina)

Durante el proceso de fabricación de las barricas, la madera sufre un importante calentamiento, pudiendo degradarse la lignina que contiene la madera, formándose otros fenoles volátiles aromáticos de aromas complejos ahumados o tostados, tales como: guayacol, metil-guayacol, etil-guayacol, propil-guayacol, alil-guayacol, siringol, metil-siringol, etc.

FLAVONOIDES

Son sustancias que presentan un color amarillo de mayor o menor intensidad, donde su molécula se caracteriza por estar formada por dos anillos bencénicos unidos por un heterociclo oxigenado, derivando un núcleo 2-fenil-cromona: flavonas y falvonoles, u otro núcleo 2-fenil-cromanona: flavanonas y flavanonoles.

Los más abundantes son los flavonoles, que se localizan en los hollejos de las variedades tintas y blancas, presentando una coloración amarilla, encontrándose en concentraciones muy variables desde 10 a 100 mg / kg de bayas de uva, y con los siguientes compuestos en su forma aglicona: Kaempferol (Vendimias tinta y blanca); Quercetina o quercetol (Vendimias tinta y blanca); Miricetina o miricetol (Vendimia tinta).

Los flavanonoles y las flavonas se encuentran en el hollejo de las vendimias blancas, destacando entre ellos la astilbina o 3-ramnósido de dihidroquercetol, la engelatina o 3-ramnósido de dihidrokaempferol, y la taxifolina o dihidroquercitina; suponiendo todos ellos un 5 por 100 de los compuestos fenólicos contenidos en los hollejos, oscilando sus concentraciones de 9 mg / kg de hollejo fresco para el primero y de 0,6 mg / kg para el segundo.

ANTOCIANOS

Los antocianos son los pigmentos tintos de la uva, que reciben su nombre del griego “antos” (flor) y “kyanos” (azul); estando localizados en el hollejo, especialmente dentro de las vacuolas de las 3 o 4 primeras capas celulares de la hipodermis; así como también en la pulpa en las variedades tintoreras, y por fin en las hojas del viñedo al final de su ciclo vegetativo anual. Su estructura comprende dos anillos bencénicos unidos por un heterociclo oxigenado, insaturado y catiónico flavilium derivado del núcleo 2-fenil-benzopirilo. Bajo la forma heterosídica se denominan “antocianinas”, bastante más estables que la forma aglicona o “antocianidinas”. Se distinguen en la Vitis vinífera cinco moléculas de antocianos monoglucósidos: cianidina, paeonidina, delfinidina, petunidina y malvidina; mientras que otras especies del mismo género: Vitis riparia o Vitis rupestris, los antocianos son diglucósidos, cuyo carácter dominante se transmite por herencia, pudiendo ser esta circunstancia la prueba determinante de un vino tinto elaborado con vendimia procedente de variedades de hídridos productores directos (HPD) prohibidos por la actual legislación.

La concentración de los antocianos en el hollejo, oscila desde los 500 mg / kg de materia fresca, hasta los 3.000 mg / kg; dominando entre ellos la malvidina en cantidades variables según variedades, desde el 50 al 90 % del total de antocianos.

La medición de los antocianos del vino se puede hacer por tres sistemas: método de variación de pH, método de decoloración por bisulfito. Indices de Maduración, índice de PVPP, e índice de ionización.

- El método de variación de pH (C) consiste en preparar dos muestras, conteniendo en las dos 1 ml de vino y 1 ml de etanol 0,1 por 100 ClH; en la primera se introducen 10 ml de ClH al 2 % (pH 0 0,7), y en la segunda se mete 10 ml de una solución tampón pH 3,5. Se miden las absorbancias a 520 nm en una cubeta de 10 mm, expresando los resultados como: C (mg / litro) = (d1 –d2) x 388

- El índice de PVPP expresa el porcentaje de antocianos combinados con los taninos. Se prepara una jeringuilla de 10 ml, colocando en la salida un poco de algodón, donde se deposita el PVPP mediante el pase de una solución acuosa hasta el nivel de 1 ml. A continuación se pasa 1 ml de vino a través del PVPP que retiene los antocianos, lavándolo seguidamente con agua, y por fin una solución compuesta de 70 ml de etanol, 30 ml de agua destilada y 1 ml de ClH concentrado, que libera del PVPP los antocianos libres (A1), siendo a continuación determinados los antocianos, corrigiendo las concentraciones en función de los factores de dilución.

- El índice de ionización expresa el porcentaje de antocianos que contribuyen al color del vino. Se preparan dos tubos de ensayo, en el primero se introduce 10 ml de vino y 2 ml de agua destilada, y en el segundo 10 ml de vino y 2 ml de bisulfito sódico al 7,0 %; tapándose con cuidado, agitándose, y al cabo de 10 minutos se miden las absorbancias a 520 nm en una cubeta de 1 mm, calculándose lo siguiente:

da = (A1 – A2) x 12 / 10

Al mismo tiempo se preparan otros dos tubos, en el primero con 1 ml de vino, 7 ml de ClH 0,1 N y 2 ml de agua destilada, y en el segundo 1 ml de vino, 7 ml de ClH 0,1 N y 2 ml de bisulfito potásico al 7,0 %; tapándose con cuidado, agitándose, y al cabo de 10 minutos se miden las absorbancias a 520 nm en una cubeta de 10 mm, calculándose lo siguiente:

db = (B1 – B2 ) x 100 / 95

Indice de ionización = da / db x 100

La medición del color de los vinos tintos se realiza con un espectrofotómetro, donde se pueden determinar los siguientes parámetros:

- Intensidad de color (IC), cuyos valores oscilan en los vinos de 0,3 a 1,8.

IC = DO 420 + DO 520 + DO 620

- Tonalidad del color (T), que expresa el nivel de evolución del color hacia el teja o naranja, oscilando desde 0,5 a 0,7 en los vinos jóvenes, hasta 1,2 a 1,3 en los vinos viejos.

T = DO 420 / DO 520

- Composición del color, que mide la contribución de cada color sobre el total.
DO 420 (% amarillo) = DO 420 / IC x 100
DO 520 (% rojo)        = DO 520 / IC x 100
DO 620 (% azul)        = DO 620 / IC x 100

- Brillo del color rojo (B), cuyos valores en un vino joven oscilan entre 40 a 60.

TANINOS

Bajo en nombre genérico de taninos se agrupan una serie de sustancias fenólicas que pueden contener los vinos, pudiendo clasificarse según su procedencia en dos grandes grupos: taninos condensados procedentes de la uva y taninos hidrolizables procedentes de la madera de roble, en el caso de que el vino permaneciese en contacto con este material.

Los taninos condensados son polímeros más o menos complejos de los flavanos-3-oles o 3-flavanoles, también llamados catequinas. Estas sustancias se localizan en el hollejo, especialmente en las capas externas de la hipodermis, en forma libre dentro de las vacuolas de las células, o en forma combinada, estando ligados a los polisacáridos de las paredes celulares; encontrándose también de forma abundante en las pepitas, localizados en la envoltura externa situada inmediatamente por debajo de la epidermis, y también en la envoltura interna que rodea al albumen. La pulpa no contiene apenas taninos, mientras que el raspón posee una buena cantidad de estas sustancias.

Los taninos más sencillos son los 3-flavanoles monómeros, estando formados por dos anillos bencénicos unidos por un heterociclo oxigenado saturado de núcleo fenil-2-cromano, pudiendo encontrarse cuatro isómeros: (+)-catequina, (-)-epicatequina, (-)-catequina y (+)-epicatequina, donde destacan especialmente los dos primeros, así como también los derivados de la epicatequina en forma de éster gálico: galocatequina, 3-galato de catequina, y 3 galato de galocatequina, siendo éstos últimos específicos de ciertas variedades del género Vitis.

Otros taninos más complejos derivados de los anteriores son las procianidinas dímeras, que se agrupan en dos categorías: procianidinas tipo A (C30H26O12) y las procianidinas tipo B (C30H24O12), siendo las primeras las más abundantes en la uva. Del mismo modo también existen procianidinas trímeras, agrupadas en los tipos C y D.

Las procianidinas oligómeros son polímeros mucho más complejos, formados por 3 a 10 unidades de favanoles; así como las procianidinas condensadas, formadas por más de 10 unidades de falvanoles, alcanzando un peso molecular superior a 3.000. Estas moléculas presentan la propiedad de liberar antocianidoles, en medio ácido y en caliente, de donde toman el nombre de procianidinas, proantocinaidinas o proantocianidoles. Antiguamente estas sustancias eran conocidas erróneamente como leucoantocianos o leucocianidoles, pues éstas derivan realmente de los 4-flavanoles y 3,4-falvanodioles que no existen en la uva.

En las pepitas los taninos se encuentran menos condensados, con un grado de polimerización cercano a 10, mientras que los de los hollejos son más complejos y con un grado de polimerización cercano a 30; encontrándose casi siempre una mayor cantidad de taninos en las pepitas. Los taninos de los hollejos se diferencian de los de las pepitas, por la presencia de epigalocatequina, por tener un mayor grado de polimerización, y también por una menor proporción de unidades galoiladas. En los vinos el contenido en taninos es muy variable, oscilando de 1 a 4 gramos / litro en los tintos, y de 0,1 a 0,3 gramos / litro en los blancos.

Los taninos hidrolizables proceden de la madera de roble, estando formados por los galotaninos y los elagitaninos, que por hidrólisis ácida liberan respectivamente ácido gálico y ácido elágico, y conteniendo ambos una molécula de glucosa. Los más abundantes pertenecen a los elagitaninos, donde destacan la vescalagina y la castalagina, que al hidrolizarse se transforman respectivamente en vescalina y castalina. Estas sustancias son muy solubles en medios hidroalcohólicos como es el vino o los aguardientes, y tienen unas propiedades muy distintas a los taninos condensados de la uva; siendo la presencia de ácido elágico una característica de los vinos criados en madera o adicionados de taninos comerciales. Los elagitaninos y los galotaninos son capaces de formar con los cationes metálicos Fe3+ y Cu2+ un gran número de quelatos que pueden precipitar.

Los elagitaninos tienen una gran capacidad de consumir oxígeno, por la presencia de varios grupos hidroxilo en posición orto, que provocan el aumento del poder oxidativo del medio, produciendo unas importantes cantidades de hidroperóxidos y también de etanal.

La medición de los taninos se puede realizar por el sistema de hidrólisis caliente en medio ácido (T), donde se preparan dos tubos con tapón de rosca, introduciendo en los dos tubos 4 ml de vino diluido 1 / 50, 2 ml de agua destilada y 6 ml de CLH 12 N; siendo el primero tapado herméticamente, protegido de la luz, y puesto al baño María a 100º C durante 30 minutos y enfriado rápidamente a continuación; mientras que el segundo tubo no es calentado. Posteriormente a ambos tubos se les añade 1 ml de etanol y después de agitados se les mide sus absorbancias a 550 nm en una cubeta de 10mm, resultando lo siguiente:

T (gramos / litro) = (D2 – D1) x 19,33

Otra sistema es calculando los taninos basándose en el método anterior, y mediante las siguientes ecuaciones:

Vinos viejos:     T (gramos / litro) = 16,16 x D2 – 24,24 x D1 + 1,71 x antocianos
Vinos jóvenes : T (gramos / litro) = 16,16 x D2 – 33,32 x D1 x 3,86 x antocianos

Otro sistema de medición de taninos propuesto por este mismo autor, consiste en medir las absorbancias de los anteriores tubos calentado y si calentar, a las longitudes de onda de 520 nm, 470 nm y 570 nm; obteniendo por cálculo los siguientes valores:
Δ 520    = D2520 – D1520
Δ520´   = 1,10 x (D2470 – D1470)
Δ 520´´ = 1,54 x (D2570 – D1570)

De estos tres valores se toma el más pequeño, y la concentración de taninos se calcula con la expresión:

T (gramos / litro) = 15,7 x Δ DO 520

En el caso de vinos blancos secos, el cálculo se realiza de la misma manera, pero sin diluir en vino o haciéndolo a 1 / 2. Para los vinos dulces, se procede con otro método, mezclando 0,2 gramos de PVPP, 5 ml de vino, y 15 ml de agua destilada; agitando durante 5 minutos y filtrando el conjunto por una membrana amicróbica que retiene el PVPP. A continuación la membrana se lava con agua, y se introduce el PVPP en un tubo con 20 ml de BuOH1- ClH (12N) (1 / 1 vol.), conteniendo 150 mg / litro de FeSO4. Después de calentar durante 30 minutos al baño María, se mide la densidad óptica a 550 nm en una cubeta de 10 mm (d1); y también sobre un testigo preparado de la misma forma pero sin calentar (d0).

T (mg / litro) = (d1 –d0) x 273

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