viernes, 17 de febrero de 2012

Aplicación del "Bacillus Aubtilis" para la Detección de Antibióticos en los Vinos


APLICACIÓN DEL "BACILLUS SUBTILIS" PARA LA DETECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN LOS VINOS

A lo largo de los años el vino ha sido tratado siempre con antifermentos. Es decir, sustancias químicas que han evitado la proliferación de levaduras y/o bacterias, con el objeto de controlar una fermentación o de evitar refermentaciones en los vinos embotellados.

La legislación ha sido siempre muy parca en hacer concesiones en este sentido, de tal modo que en la actualidad sólo están autorizados el anhídrido sulfuroso y el ácido sórbico o su sal potásica, el sorbato potásico.

El anhídrido sulfuroso está cada vez más controlado en el sentido de que al parecer algunos derivados orgánicos de los sulfitos pueden ser inductores de determinados cánceres. La tendencia mundial está encaminada a disminuir su uso y bajar el nivel máximo autorizado. Recordemos que el IDA del anhídrido sulfuroso es de 0’7 mg/Kg de peso corporal. Se están incluso haciendo grandes esfuerzos de investigación tecnológica con el objeto de poder conseguir elaborar vinos sin sulfuroso, objetivo en mi opinión cuestionable a la luz de los resultados de las investigaciones realizadas hasta la fecha.

El anhídrido sulfuroso es poco activo frente a levaduras, motivo por el cual se adiciona a veces conjuntamente al vino en el momento del embotellado, una cierta dosis de sorbato potásico que presenta una mayor actividad frente a las levaduras. Este es, contrariamente al anhídrido sulfuroso, poco activo frente a las bacterias acéticas o lácticas propias del vino.

El sorbato con el tiempo y la temperatura, o la eventual actuación de las bacterias lácticas, llega a descomponerse dando Geraniol, producto conocido por la mayoría de enólogos por el típico olor a geranio que confiere al vino. Esta característica negativa supone un cierto freno en el empleo de este conservante. Por estos motivos, fraudulentamente, han sido utilizados en los últimos decenios una plétora de productos con propiedades bacteriostáticas o bactericidas, fungiestáticas o fungicidas. Todos ellos desde luego no autorizados. La lisozima, autorizada en 1997 por la O.I.V., está todavía poco experimentada y no disponemos de resultados de su aplicación en el normal embotellado de los vinos.
A la vista de esta resumida historia y de algunos indicios, cabe pensar en la posibilidad del uso de determinados antibióticos como estabilizantes microbiológicos del vino. En este momento su uso sería fraudulento y por lo tanto punible, lo cual justifica poner a punto un método para detectar su presencia en los vinos. Pensamos que quizás en un futuro, algunos antibióticos puedan ser autorizados. En tal caso también sería necesario establecer algún mecanismo de control.

LA ELECCIÓN DE UN ANTIBIÓTICO

Cualquier antibiótico que sea susceptible de ser utilizado cómo antimicrobiano en un vino deberá cumplir algunos requisitos:

- que sea estable y activo a pH ácido.
- que no confiera olores y/o gustos al vino tratado.
- que se emplee a dosis bajas y sea soluble.
- que sea económico.
- que actúe frente a Gram positivos (bacterias lácticas) y Gram negativos (bacterias acéticas) y mejor todavía si tiene algún efecto sobre levaduras.

Teniendo en cuenta todos estos factores, la larga lista de antibióticos disponibles en el mercado se resuelve en unos pocos que listamos a continuación: Eritromicina; Miconazol; Tetraciclina ClH; Nitrofurantoina; Nistatina; Ampicilina; Oxitetraciclina; Gentamicina; Penicilina G.
 

Sus precios en el mercado oscilan desde unas 9.000 Ptas/Kg para la Tetraciclina Clorhidrato, a unas 100.000 Ptas/Kg para la Gentamicina.

A una dosis media de 2 g/Hl, tratar un hectolitro de vino costaría de 18 a 200 Ptas. Con ellos se han realizado diversos antibiogramas sobre cultivos de Lactobacillus, que han permitido poner de manifiesto la actividad bactericida específica de cada uno. La Nistatina tiene además una gran actividad frente a Saccharomyces Cerevisae.

Hemos seleccionado previamente todos aquellos que presentan actividad a pH ácido, por ser éste el del vino, y bajo este criterio la elección ha recaído en los antibióticos usados para combatir infecciones de las vías urinarias altas y bajas, y que se detectan como tales en la orina de los pacientes cuyo valor de pH oscila alrededor de 5’0.

Estos antibióticos en la práctica médica se utilizan por vía oral en su mayor número. Una vez pasan al torrente circulatorio llegan por fin al riñón o a las vías urinarias bajas en donde ejercen su acción.

MATERIAL Y MÉTODOS

Los bacilos producen en su catabolismo una cierta cantidad de nitritos, los cuales mediante una reacción de diazotación con ácido sulfanílico y dicloruro de N-(1 naftil) etilendiamonio pueden evidenciarse porque el medio se colorea de color rosa-violeta según sea el pH de éste medio y la concentración de nitritos.

Si introducimos un antibiótico en el medio, los bacilos mueren, y por lo tanto no hay producción de nitritos, por lo cual el medio nutritivo conserva su color original.

En este caso, se trata de una tira reactiva, es decir, un soporte de plástico con una zona que engloba una película impregnada con esporas de Bacillus Subtilis liofilizadas y estabilizadas colocada sobre un papel de filtro impregnado de un medio nutritivo y el indicador. Cuando la tira se sumerge en el vino se humedece el soporte de papel de filtro, con lo cual se rehidratan y activan los bacilos y el medio de cultivo y el indicador se hallan en condiciones de funcionamiento. Obviamente antes de realizar el test de antibióticos será necesario anular la acción del anhídrido sulfuroso añadiendo un aldehído al vino. Señalamos en este punto que el uso de antibióticos no pude sustituir al anhídrido sulfuroso por cuanto a su actividad antioxidante se refiere.

Para la realización práctica del test actuaremos de la siguiente manera:
1. Pipetear 10 ml de vino en un tubo de ensayo.
2. Añadir 0’2 ml de una solución acuosa de Benzaldehído al 0’2%. Agitar y dejar 5 minutos.
3. Sumergir la tira en el vino así tratado. Al retirarla, rozar el canto lateral de la tira reactiva en el borde del tubo de ensayo para eliminar el exceso de vino.
4. Introducir la tira reactiva en un tubo de incubación y cerrarlo bien.
5. Incubar en estufa a 37
6. Hacer la evaluación con el tubo cerrado, observando la aparición de un color rosado

Evaluación:
- Coloración rosada o roja : Negativo
- Coloración blanca o beige : Positivo

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los vinos analizados hasta el momento (100 de la zona de Catalunya y 124 del resto de España) han presentado todos, resultado negativo.

Las concentraciones de antibiótico ensayadas corresponden a las que presumiblemente deberían dosificarse en un vino para producir una acción bactericida (de 10 a 50 mg/l). Estas concentraciones han sido halladas experimentalmente dosificando diversas concentraciones de cada antibiótico testado sobre distintos vinos adicionados de Lactobacillus con una concentración final de 5.000 UFC/ml, y/o levaduras del género Saccharomyces a idéntica concentración.

El método propuesto es muy ventajoso sobre otros métodos microbiológicos tradicionales, por su validez, sencillez, sensibilidad y fiabilidad. El test será valido después de haber descartado la presencia en el vino a analizar de otros antifermentos. Puede utilizarse también como "screening" para evidenciar la presencia de antifermentos en general. En caso positivo será imprescindible recurrir a técnicas específicas de análisis para conocer el antibiótico utilizado o el antifermento presente en el vino.

Fuente: Ramón Viader Guixà; Laboratorios Viader Análisis, S.L. Sant Sadurni d’Anoia

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