viernes, 17 de febrero de 2012

Selección de Levaduras de Ácido Málico para la Acidificación de Vinos


SELECCIÓN DE LEVADURAS PRODUCTORAS DE ÁCIDO MÁLICO PARA LA ACIDIFICACIÓN DE VINOS

La biosíntesis de ácido málico como producto secundario de la fermentación alcohólica a partir de la carboxilación del ácido pirúvico y posterior reducción del oxalacetico formado, se conoce en Enología desde hace más de cincuenta años. No obstante, la aplicación de esta propiedad biosintética para aumentar el contenido ácido de los vinos, es más reciente (FATICHENTI y col., 1978; Schwartz y col. 1988; FARRIS ,1989; Pronk y col, 1996; FEUILLAT, 1997).

En trabajos anteriores de nuestro grupo de investigación en el Laboratorio de Enología de la Universidad Politécnica de Madrid, estudiando la capacidad degradativa de ácido málico a cargo de cepas de levaduras autóctonas de D.O Navarra, D.O. Cariñena, D.O. C. Rioja y D.O. Somontano, (GONZÁLEZ, 1993; LEÓN y col., 1994, NAVASCUÉS, 1995) se han observado niveles de este ácido superiores al contenido inicial del mosto de partida, por lo que se presupone el origen de tal incremento en la línea antes apuntada.

Los objetivos del presente trabajo se centran en comprobar la capacidad metabólica de cuatro cepas de Saccharomyces cerevisiae para producir ácido málico durante la fermentación alcohólica y estudiar la influencia que sobre esta capacidad biosintética tienen los factores pH y temperatura de fermentación.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se ha estudiado la capacidad de producción de ácido málico a cargo de cuatro cepas de la sp. Saccharomyces cerevisiae pertenecientes a la colección de levaduras autóctonas del Laboratorio de Enología de la Universidad Politécnica de Madrid, y originarias de diferentes Denominaciones de Origen Españolas. Estas cepas objeto de estudio han sido
seleccionadas previamente en función de los siguientes caracteres tecnológicos:

- Alto poder alcoholígeno.
- Cinética de fermentación adecuada.
- Mínima producción de acidez volátil.
- Respuesta óptima a bajas temperaturas de fermentación
- Resistencia al SO2.
- Mínima producción de SH2.
- Elevada producción de glicerol.
- Factor Killer.
- Perfil aromático adecuado.
- Ausencia de carácter filmógeno y otras propiedades secundarias de interés enológico.
- Ausencia de caracteres sensoriales negativos.

Para estudiar la capacidad de formación de ácido L-málico de las cepas y la influencia de la temperatura de fermentación y pH sobre esta, se emplea como sustrato mosto de uva de la variedad Palomino Fino, y que presentaba la composición química siguiente:

Azúcares 220 g/L
pH 3.48
Acidez total 2.41 g/L TH2
Ácido L- málico 760 mg/L

Se ha elegido este sustrato de partida por su bajo contenido en ácidos orgánicos, representativo de un mosto de una zona vitivinícola cálida.

El mosto se distribuye en matraces estériles de 500 mL a razón de 250 mL por matraz, habiendo sido previamente esterilizado por filtración amicróbica.

Para comprobar la influencia del pH sobre la capacidad metabólica que las cepas en estudio tienen para producir ácido L-málico se acidifica el medio anterior con ácido cítrico hasta pH 3.08. El medio acidificado se distribuye en matraces estériles de 500 mL a razón de 250 mL por matraz, habiendo sido previamente esterilizado mediante filtración amicróbica.

Las cepas a examen se cultivan previamente en medio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) de DIFCO, y a partir de cultivos jóvenes de 48 horas se realizan las siembras. Las inoculaciones se efectúan con 10 mL de una suspensión celular que contiene 10x106 UFC/mL. Una vez sembrados se incuban a 5ºC, 10ºC, 15ºC y 20ºC controlando los días que dura la fermentación alcohólica en cada ensayo.

Finalmente, para comprobar si la biosíntesis de ácido L-málico va acompañada de un perfil aromático correcto, se lleva a cabo el análisis de los componentes principales de la fracción volátil de los fermentados a partir de las cepas objeto de estudio y se comparan con un testigo fermentado con LSA.

Los ensayos se realizan por triplicado.

Se siguen los Métodos de Análisis Comunitarios al Sector del Vino, Reglamento C.E., nº 2676/90.

Para determinar la concentración de ácido L-málico en mostos, vinos y medios sintéticos se emplean dos técnicas:

- Extracto analizado por CLAE usando un equipo Waters 600 E, equipado con dos bombas M-6000 A, un inyector Universal M-U6K, un Detector de Absorbancias M-440V y un Sistema Controlador 720. Columna empleada es Nova-Pak C18 (fase reversa) de 3,9 mm I.D. x 300 mm L. Se emplea un Detector de absorción de UV-VIS A 190 mm.

Como eluyente se emplea H2O 99,98 % / Ácido Fórmico 0,002 %.

La muestra es diluida 1/10 y filtrada por 0,45 mm. el volumen de inyección es de 3 mL.

- Método enzimático de Boerhringer-Manheim con Malato-deshidrogenasa, investigando la aparición del NADH a 340 nm.
Para la determinación de la fracción volátil:

- Cromatografía de Gases utilizando un Cromatógrafo Hewlet-Packard Serie II equipado con detector de ionización de llama y columna capilar cromatográfica de CARBOWAX 1500 al 15% sobre Chramosorb W80-100 mallas de 50 metros de longitud. como patrón interno se utiliza 4-metil 2-pentanol.

Para el análisis microbiológico se han seguido las técnicas de selección de cepas microbianas de interés enológico descritas por SUÁREZ e IÑIGO (1992), y las normas BIDAN (1990) para análisis de microorganismos del vino.
Todas las pruebas analíticas se realizan por triplicado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados correspondientes a la capacidad biosintética de ácido L-málico y la influencia que sobre la misma tiene la temperatura en la formación de ácido L-málico durante la fermentación del mosto a cargo de Saccharomyces cerevisiae
Ácido L- málico en mosto 760 mg/L

La fermentación a 5ºC no se inició antes de los 20 días desde la siembra de las cepas en el mosto, por lo que no se tiene en cuenta en los resultados.

Se observa que la máxima producción de ácido L-málico se registra una vez concluida la fermentación alcohólica a 15ºC, que llega a producir 570.2 mg/L de ácido L-málico. A 20ºC la misma cepa biosintetiza 502,8 mg/L, medida la concentración una vez finalizada la fermentación la capacidad productora de la cepa se sitúa en torno a los 320 mg/L en final de fermentación a 15ºC.

A la vista de los datos se afirma que la temperatura óptima de fermentación para la biosíntesis de este ácido se sitúa en torno a los 15ºC, en el intervalo situado entre 15ºC y 20ºC, ya que a 10ºC esta capacidad anabólica se ve ligeramente reducida.

En cuanto al periodo de producción de ácido L-málico, se observa que en los 10 primeros dias de fermentación alcohólica tiene lugar el mayor porcentaje de biosíntesis de ácido L-málico, suponiendo en la mayoría de los casos el 90% del total.

Los resultados correspondientes a la influencia conjunta del pH y temperatura sobre la capacidad biosintética de ácido L-málico de las cepas objeto de estudio y como en el caso anterior, a 5ºC no se inició la fermentación alcohólica hasta 25 días después de sembrado el mosto, por lo que se tiene en cuenta en los resultados.

Analizando los datos de producción de ácido málico a distinto pH, se puede observar que a pH 3.48 la producción es notablemente superior que a pH 3.08, significando en algunos casos más de un 50%, resultados concordantes con los obtenidos por FARRIS y col. (1997). Por tanto, la biosintesis de ácido L-málico se ve beneficiada por valores de pH altos, es decir, valores teóricamente correspondientes a mostos de vendimias cálidas.

Analizando la influencia de la temperatura de fermentación, se puede observar de nuevo que independientemente del pH , el valor óptimo de temperatura se sitúa en torno a 15ºC - 20ºC, disminuyendo la formación de ácido málico a 10ºC. La fermentación controlada de vinos blancos a temperaturas cercanas a 15ºC contribuiría a la producción de ácido L-málico de las cepas estudiadas, confirmándose el caracter criotolerante de las mismas, CASTELLARI y col. (1992).

Los datos correspondientes al perfil de volátiles de los fermentados a partir de las cepas objeto de estudio y una cepa testigo LSA. La temperatura de fermentación en todos los casos es de 15ºC, valor considerado óptimo para la biosíntesis de ácido L-málico a cargo de las cepas. El sustrato de partida es mosto de la variedad Palomino Fino, cuyas características químicas ya se han descrito anteriormente.

Los compuestos volátiles estudiados al término de la fermentación alcohólica en cada uno de los ensayos realizados a 15ºC evidencian como aspectos más destacables la disminución en las concentraciones de acetaldehido, acético y acetato de etilo formadas por las cepas objeto de estudio, con respecto al testigo fermentado con LSA. El resto de componentes volátiles investigados, particularmente los alcoholes superiores alcanzan cotas bajas muy inferiores a los 400 mg/L citados por numerosos autores como concentración a partir de la cual pueden depreciar organolépticamente los aromas secundarios.

Las cuatro cepas presentan un perfil de volátiles correcto, con concentraciones de todos los parámetros analizados dentro de los valores considerados normales por la literatura. En relación con la LSA, las diferencias no son significativas.

CONCLUSIONES

Dado que las características de acidez del mosto empleado en la fermentación son representativas de un mosto de una vendimia de zona cálida, la fermentación controlada a 15ºC y dirigida con cualquiera de las cepas, da como resultado una acidificación málica del vino resultante, que puede contribuir a disminuir la adición de sustancias acidificantes. Con ello se evitan desequilibrios organolépticos por acidificación y posibles enfermedades originadas por un aporte excesivo de ácidos.

Por otra parte, el empleo de levaduras autóctonas seleccionadas para dirigir la fermentación elimina parcialmente la necesidad de utilización de LSA, salvo en situaciones especiales.

Es necesaria la verificación a escala industrial de estas experiencias en bodega, dado su interes aplicado en la acidificación de vinos de zonas cálidas.

Fuente: Calderón F., Navascués, E., Varela, F., Colomo, B., Suárez, J.A. Departamento de Tecnología de Alimentos. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. Universidad Politécnica de Madrid

3 comentarios:

  1. ¿Porqué nos empeñamos en hacer del vino un producto industrial cuando es mucho más apasionante, interesante y gratificante la aventura de disfrutar de un artesano, con sus defectos y bondades?.

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    1. Estoy completamente deacuerdo con tigo, no hay nada como un producto natural que represente en sus colores, sabores y aromas el lugar del que procede.

      Cuanto menos manipulaciones mucho mejor. Pero por otra parte en los últimos años todas las regiones del mundo quieren hacer vino, porque parece ser que si no haces vino, te falta algo.

      Hay muchos lugares que en realidad no son los idóneos para hacer determinados productos y por eso necesitan ser manipulados o ayudados por la ciencia. En este caso esta levadura ayudaría a hacer supuestamente mejores vinos en lugares demasiado calidos donde la uva tiene una cadencia de acidez. También para lugares que en su día fueron aptos, pero que se están viendo afectados duramente por el cambio climático, etc.

      Supongo que el debate esta servido…

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  2. Este comentario ha sido eliminado por el autor.

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