lunes, 5 de marzo de 2012

Método Rápido para la Determinación del Carácter “Brett” en los Vinos


MÉTODO RÁPIDO PARA LA DETRMINACIÓN DEL CARÁCTER "BRETT" EN LOS VINOS

La industria del vino necesita métodos rápidos para detectar y cuantificar las levaduras, tanto para el control de la fermentación como para la detección de microorganismos contaminantes. A menudo, como en el caso de Brettanomyces bruxellensis, los microorganismos se pueden encontrar en estado vital pero no cultivable (VBNC) y por tanto la búsqueda con las técnicas microbiológicas tradicionales puede resultar más difícil. En presencia de B. bruxellensis el tratamiento correctivo debe ser efectuado inmediatamente con el fin de evitar grandes daños económicos.

El objetivo de este trabajo era la optimización de un método rápido para la búsqueda de B. bruxellensis mediante una técnica cuantitativa cultivo-independiente, Real-time PCR (qPCR).

PCR EN TIEMPO REAL

PCR cuantitativa, qPCR, Q-PCR (del inglés quantitative polymerase chain reaction) o PCR en tiempo real (del inglés real time PCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que también se le denomina PCR en tiempo real. En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa, RT-PCR en tiempo real o RT-Q-PCR. Debe evitarse la confusión con la técnica denominada "PCR tras transcripción inversa" (RT-PCR, del inglés reverse transcriptase PCR), en la cual existe un paso de retrotranscripción de ARN a ADN pero que no necesariamente cuantifica el producto a tiempo real.

La PCR cuantitativa junto a los chip de ADN son modernas metodologías para el estudio de la expresión génica, aunque otros métodos tradicionales como el Northern blot, si bien, no con tanta precisión, también permiten su abordaje. La variabilidad que se introduce en la cuantificación y que conlleva a un error en la estima deriva de la integridad de ADN, eficiencia enzimática y otros muchos factores, por lo que se han desarrollado numerosos sistemas de estandarización. Los hay para cuantificar de forma absoluta la expresión génica, pero, de forma más común, se orientan a la cuantificación relativa del gen de estudio respecto de otro, denominado "normalizador", que se selecciona debido a su expresión casi constante; estos genes suelen denominarse, en inglés, house-keeping genes debido a que suelen estar involucrados en funciones básicas en la supervivencia celular, lo cual suele implicar una expresión constitutiva. De este modo, efectuando en cada experimento la medición de los genes de interés y dividiéndolos por la expresión del gen normalizador seleccionado es posible comparar los primeros aún sin conocer en términos absolutos su nivel de expresión. Los genes normalizadores más empleados son aquellos que codifican para las siguientes proteínas: tubulina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina, RNA ribosomales, etc.

FUNDAMENTO

La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de el ADN polimerasa.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten en 25 - 40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mínimo de tres etapas: la primero, en torno a los 95 °C, permite la separación de los ácidos nucleicos de doble cadena; el segundo, a una temperatura en torno a los 50-60 °C, permite el alineamiento de los cebadores al ADN molde; el tercero, a 68 - 72 °C, facilita la polimerización por parte de la ADN polimerasa. Debido al pequeño tamaño de los fragmentos amplificados usualmente en este tipo de PCR puede omitirse el último paso, pues la enzima es capaz de amplificar durante la rampa entre la temperatura de alineamiento y la de desnaturalización. Además, algunos termocicladores añaden a cada ciclo unos segundos a otra temperatura, por ejemplo 80 °C, a fin de reducir el ruido por la presencia de dímeros de cebadores cuando se emplea un colorante inespecífico. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros, como: la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos (dNTPs) en la reacción y la temperatura de unión de los cebadores.

CLASIFICACIÓN

Podemos clasificar las técnicas de PCR cuantitativa según el empleo de fluorocromos no específicos o bien de sondas moleculares dependientes de la secuencia.

En las técnicas basadas en fluorocromos inespecíficos se detecta la generación exponencial de ADN de doble cadena empleando un fluorocromo que se une inespecíficamente a aquél. Un ejemplo de colorante que permite esta detección es el SYBR Green), que, excitado mediante luz azul (λmax = 488 nm) emite luz verde (λmax = 522 nm). Posee la ventaja de requerir sólo un par de cebadores para efectuar la amplificación, lo que abarata su coste; sin embargo, sólo es posible amplificar un producto en cada reacción.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan al menos un oligonucleótido marcado fluorescentemente. Típicamente esta sonda está unida a dos fluorocromos e hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); esto es, en el amplicón. De este modo, cuando la sonda está intacta, presentan una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando los dos fluorocromos están distantes debido a la degradación de la sonda mediante la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa, o bien debido a la separación física de los fluorocromos por un cambio en la conformación de la sonda. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

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