jueves, 13 de septiembre de 2012

Inoculación de Levaduras Seco Activas en Bodegas de Castilla La Mancha


ÉXITOS Y FRACASOS EN LA INOCULACiÓN DE LEVADURAS SECO ACTIVAS EN BODEGAS DE CASTILLA LA MANCHA

Nuria Barrajón Simancas
R. Martín de Vidales Calvo
S. Alonso Infante
A. 1. Briones Pérez

RESUMEN

Castilla La Mancha es la región con la mayor superficie dedicada al cultivo de
la vid, y, el empleo de cultivos seleccionados industriales de levaduras
fermentativas es habitual en sus vinificaciones, de hecho, es la región que más
levaduras comerciales utiliza. No obstante, a pesar de emplear cultivos iniciadores
puede ocurrir que la levadura inoculada no se logre imponer en el proceso y por tanto, no sea la responsable de dirigir la fermentación, ya que generalmente se desconocen sus porcentajes de implantación. El objetivo de este trabajo es comprobar la imposición e implantación de las levaduras seco activas empleadas en doce depósitos inoculados. Los resultados mostraron, que sólo en un 30 % de Jos tanqucs muestreados, hubo una correcta implantación. En el resto de los casos, la cepa comercial no logró dominar el proceso o lo hizo de forma medianamente eficaz.

1. INTRODUCCIÓN

La fermentación alcohólica es el requisito imprescindible para la elaboración de vino. El papel que desempeñan las levaduras es fundamental, ya que utilizan los azúcares del mosto (glucosa y fructosa) y otros componentes de la uva como sustratos para su crecimiento, convirtiéndolos en etanol, dióxido de carbono y otros productos metabòlicos que contribuyen a la composición química y a la calidad sensorial del vino.

Paralelamente a esta operación metabòlica se sucede toda una serie de cambios en la composición del medio, que transforman totalmente el mosto en vino.
En Enología, independientemente de otros factores, las levaduras desempeñan un papel relevante en las características del producto final y existe la convicción de que para obtener vinos de calidad se requiere, entre otros aspectos tecnológicos, la elección de una cepa de levadura adecuada; de modo que la calidad de los vinos puede ser considerada como una consecuencia directa de la evolución de la flora microbiana del mosto durante la fermentación. Durante el proceso, se crea un pequeño ecosistema en el que se sigue el principio de sustitución característico de los procesos fermentativos donde, en condiciones naturales, se suceden las poblaciones de microorganismos espontáneos. Las condiciones del proceso (anaerobiosis, agotamiento de ciertos nutrientes y la concentración de etanol) evolucionan de forma constante y crean competencias entre los organismos: las levaduras de los géneros Kloeckera, Hanseniaspora, Candida y Pichia, resistentes a altas concentraciones de azúcares y crecen durante los primeros estadios de la fermentación, pero a medida que se modifica la composición del medio acaban muriendo o dejando paso a las especies del género Saccharomyces resistentes al etanol, que completan el proceso como levadura dominante.

Prácticamente hasta las últimas décadas, las regiones de tradición vitivinícola elaboraban sus vinos con levaduras indíge¬nas, es decir, con fermentación espontánea. Actualmente, con la producción de vino a gran escala y donde tanto la calidad del mosto como el flavor del vino se tienen en cuenta, se impone el uso de cultivos iniciadores de levaduras seleccionadas para llevar a cabo una fermentación segura y obtener vinos de calidad homogénea y predecible.


Por ello, desde hace ya una decena de años, el empleo de cultivos industriales de levaduras seleccionadas se ha hecho extensivo a todo el sector enològico: una única cepa, conocida y controlada, es responsable de la etapa fermentativa en la vinificación. Evidentemente, el inoculo no puede ser una levadura cualquiera, sino que debe tratarse de una previamente seleccio¬nada que evite anomalías como paradas fermentativas y, en definitiva influya en una mejor calidad del vino, tanto del gusto como del aroma. La selección de cepas con características enológicas determinadas ha permitido en los últimos años proporcionar a los enólogos un amplio abanico de levaduras  donde elegir, dependiendo de las características fermentativas deseadas y el estilo del vino que se vaya buscando.

La práctica del levadurado (adición de LSA) del mosto de uva se hace imprescindible cuando se trabaja en depósitos de fermenta¬ción de gran capacidad, donde los riesgos de desviación sensorial y de paradas de fermentación son mayores, en vendimias con escasa calidad sanitaria o en fermentaciones difíciles (elevado grado alcohólico potencial, calidad nutricional escasa, bajas temperaturas de fermentación, falta de control de temperatura en bodega).

Pero ninguno de los beneficios de las levaduras seleccionadas podría aprovecharse si los cultivos iniciadores se utilizan inadecuadamente Es imprescindible el correcto uso del inoculo para evitar retrasos en el inicio del proceso. Por otra parte es conve¬niente estudiar la implantación de la cepa inoculada a lo largo de la fermentación alcohólica. Mediante el uso de técnicas de biología molecular ha sido posible demostrar que una levadura inoculada se impone en el tanque de fermentación, y lo hace a unos niveles tales que conduce la fermentación vínica. Esta implantación es posible gracias a la inoculación masiva de una población viable de levaduras, que desplaza a la microbiota autóctona presente en mostos y uvas.

Las cepas de levadura seleccionada se preparan en fábrica a partir de cultivos puros de levaduras multiplicados en condiciones óptimas y posteriormente sometidos a un proceso de desecación y deshidratación. Los preparados comerciales de LSA contienen de forma general entre 2-2,5 10 10 ufe/gramo: a las dosis recomendadas, población más que suficiente para desencadenar la fermentación alcohólica. No obstante, el inicio de la fermentación alcohólica no es indicativo de una fermentación dirigida sin problemas y con éxito en la implantación. El grado de eficacia en la aplicación de LSA, es decir su correcta implantación a lo largo de la fermentación depende de: la calidad industrial del preparado de LSA, la cantidad de células vivas dispuestas a iniciar la fermentación, del estado fisiológico de las células después de la rehidratación, de la competitividad propia de cada cepa de levadura seleccionada y de la población autóctona presente en el mosto/uva a fermentar.

Para que la cepa seleccionada se imponga hay que conseguir un número suficiente de levaduras vivas y en buen estado fisiológico, donde son factores clave: la dosis de levadura seca y la etapa de rehidratación, proceso fundamental en la recuperación de levaduras activas y resistentes, dispuestas para agotar todo el azúcar del mosto. En esta etapa influyen factores como la Temperatura (se debe evitar una diferencia de temperatura >10 °C entre el medio de rehidratación y el mosto, para impedir un shock térmico que pueda producir mutaciones en la cepa seleccionada); el Medio, aunque habitualmente es agua, se recomienda el empleo de disoluciones de sacarosa al 5% (p/v), o del propio mosto, que suponen una fuente inicial de nutrientes, pero generalmente se desconocen los porcentajes de recuperación de células según el medio de rehidratación empleado, así como de la efectividad del aporte de nutrientes durante la rehidratación; el Tiempo que dure el proceso, ya que en sus primeros momentos de vida, las células de levadura se alimentan de su azúcar de reserva, la trehalosa. A partir de cierto tiempo las reservas de trehalosa se agotan y la población celular comienza a morir.

Una vez optimizadas todas las variables, se determinará la dosis de levadura seleccionada que se debe añadir en función de la población autóctona previsible, de las condiciones de crecimiento en el mosto (azúcares/ NFA), de la temperatura de fermentación, de la presencia de S02 y del grado alcohólico probable. Cuanto más difíciles sean las condiciones de crecimiento y fermentación, mayor tendrá que ser el número de células a aportar; en ocasiones se adicionan de 15 a 20 millones de células/mL, es decir alrededor de 50 g/hL.

Teniendo en cuenta el elevado precio que normalmente tienen estos cultivos y las dosis medias que se utilizan (15-25 g/Hl. de mosto o 100 Kg. de uva), la mejora de la eficacia en su empleo  puede redundar además en un beneficio económico considerable, ya que supondrá un ahorro en el proceso de vinificación.

Castilla La Mancha es la región con la mayor superficie dedicada al cultivo de la vid, y el empleo de cultivos seleccionados industriales de levaduras fermentativas es habitual en sus vinificaciones; de hecho, es la región que más levaduras comerciales utiliza. No obstante, a pesar de emplear cultivos iniciadores puede ocurrir que la levadura inoculada no se logre imponer en el proceso y por tanto, no sea la responsable de dirigir la fermentación, ya que generalmente se desconocen sus porcentajes de implantación. El objetivo de este trabajo fue comprobar la imposición e implantación de las levaduras seco activas empleadas en doce depósitos inoculados.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

Recogida de muestras

Durante la vendimia de 2005, se visitaron nueve bodegas y cooperativas de la región de La Mancha, y se muestrearon doce depósitos de las variedades Airén, Cabemet Sauvignon y Shiraz (nombrados 1-12), inoculados cada uno de ellos con distintas cepas comerciales de LSA (nombradas como A-G).

En cada bodega se recabaron los datos necesarios para cumplimentar unas fichas de trabajo en donde se recopilaba información relacionada con el protocolo de rehidratación de las levaduras seco activas utilizado (medio de rehidratación, tiempo del proceso, temperatura del mosto, empleo de agitación o adición de nutrientes).

De cada uno de los tanques se tomaron muestras en dos momentos de la fermentación; inicio (densidad = 1070-1080) y mitad (densidad « 1040), resultando un total de 24 muestras que, adicionadas de glicerol, se conservaron en congelación a -70 °C hasta su análisis.

Paralelamente se tomaron muestras para los análisis físico-químicos.

Recuento y aislamiento de levaduras

Para llevar a cabo el recuento de las levaduras presentes en cada depósito y etapa de fermentación cada muestra y/o sus diluciones seriadas se sembraron en superficie sobre Agar YPD. Tras la incubación de las placas a 28 °C / 48 h se recontaron las ufc/mL y de aquellas contables se realizó una réplica sobre Agar Lisina; estas placas se incubaron a 28 °C/ 48-72 h. La finalidad de la siembra en este medio era descartar los aislados de levaduras no Saccharomyces.

De cada placa de Agar YPD (tras comparación con las de Agar Lisina) se eligieron, al azar, 20 colonias del género Saccharomyces, de las que se obtuvieron cultivos puros para su posterior identificación a nivel de cepa.

Análisis de restricción del DNA mitocondrial

Esta técnica de biología molecular, permite de modo rápido y fiable obtener información acerca de la diversidad de cepas que coexisten en un tanque de fermentación.

Para el análisis de restricción del DNAmt, los cultivos de Saccharomyces se crecieron en YPD (1 % extracto de levadura, 2 % peptona, 2 % glucosa) durante 18 horas y las células una vez cosechadas se lavaron con agua estéril. La extracción del DNA y el análisis de restricción se efectuaron siguiendo el protocolo propuesto por Querol y colaboradores (1992). Un volumen de 10 μL de DNA se digirió con la endonucleasa Hinfi (Boehringer Mannheim). Los fragmentos de restricción se separaron en un gel de agarosa al 1.5 % adicionado con bromuro de etidio (0.5 μg mL). Se realizó una electroforesis horizontal a 120 V durante 2 horas. En los pocilios del extremo del gel se dispusieron, como marcadores, el DNA de las cepas de LSA  comercial usada en las bodegas muestreadas para comprobar si su perfil genético correspondía con el de los aislados obtenidos durante la fermentación.

Identificación de levaduras no Saccharomyces

Se consideró interesante el conocer la coexistencia, durante la fermentación, de estas levaduras con el cultivo iniciador ya que es un dato de interés acerca de la compctitividad de la LSA usada.

Se identificaron mediante PCR-RFLP (Polymerase Chain Reac¬tion/Restriction Fragment Length Polimorphism) amplificando la región correspondiente del DNA, para digerirla después con las enzimas de restricción adecuadas. (Fernández González et al., 2000).

Para la prueba PCR-RFLP, se emplearon los cebadores ITS 1 que amplifican zonas variables e intergénicas (ITS1 e ITS4) del gen 5.8S del rDNA. Los productos de amplificación se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 % (p/v) al que se le había añadido una solución de bromuro de etidio (0.5 μ mL).

Para identificar las levaduras a nivel de especie, los productos de amplificación se digirieron con tres enzimas de restricción (Hinfl, Cojl y HaeIII). Las condiciones de la reacción fueron las indicadas por el suministrador (Boehringcr Mannheim GmbH). Los fragmentos de restricción se comprobaron por electroforesis en un gel de agarosa con bromuro de etidio en las concentraciones ya indicadas.
Los geles de agarosa se visualizaron en un transiluminador UV y se trataron en un sistema de documentación de geles (Gene Flash)

Análisis Físico-Químicos

A cada una de las muestras se les determinó el contenido en S02 por iodometría, la acidez total por valoración, el nitrógeno asimilable por un método abreviado (Aemy, 1997) y el amínico, por el método ÑOPA (Dukes & Butzke, 1998)

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como era de esperar en casi todas las muestras los recuentos de Saccharomyces fueron mayoritarios; no obstante, en varias bodegas y/o depósitos se aislaron levaduras pertenecientes a otros géneros; así, a pesar de que se trataba de fermentaciones inocu¬ladas, en algunos de los depósitos, e incluso a mitad de proceso, se aislaron entre un 2-5 %, especies como, Kluyveromyces thermotolerans (5 %), Pichia membranaefaciens (4 %) y Zygo-saccharomyces microellipsoides (2 %).

En cuanto a los análisis físico-químicos, en la mayoría de las muestras los resultados obtenidos reflejan que estos parámetros oscilan entre los valores habituales en vinificación; no obstante donde se observa mayor variabilidad es en la concentración de nitrógeno, factor fundamental de la capacidad fermentativa y de adaptación de las levaduras.

ÉXITOS Y FRACASOS EN LA INOCULACIÓN DE LEVADURAS...

De entre las colonias identificadas como Saccharomyces, se seleccionaron 20 al azar de cada una de las muestras para su caracterización a nivel de cepa, mediante el análisis de restricción del DNA mitocondrial; esta técnica se aplicó también a las levaduras comerciales usadas para la inoculación de los tanques.

Por comparación de los perfiles genéticos de las colonias aisladas y los patrones comerciales se pudo determinar si la cepa inoculada se había impuesto en el proceso de fermentación. La implantación sólo habrá ocurrido de modo eficaz si más del 80 % de los aislados se correspondía con la cepa comercial, sin embargo cuando estos valores oscilaban entre el 50 % y el 80 % el proceso era medianamente eficaz, y si la imposición de la LSA era menor del 50 %, resultaba ineficaz.

Se observa que en plena fermentación la LSA se impuso en más de un 80 %, e incluso al 100 % en cuatro de los tanques estudiados, a pesar de que, en alguno de ellos, se encontraba en nula o baja proporción al inicio del proceso; la siembra de la cepa comercial se realizó en todos los casos a las dosis recomendadas por el fabricante. En otros tres tanques la levadura comercial sólo se aisló en un 60, 67 y 70% respectivamente, por tanto, tendríamos que decir que su implantación ha sido medianamente eficaz y que en la fermentación están coexistiendo con otras poblaciones de cepas Saccharomyces. Hay que decir que en dichos depósitos la dosis usada de LSA está por debajo de la recomendada, y quizá no haya suficiente número de células vivas dispuestas a competir con la población autóctona.

En uno de los depositos, aunque se empleó una dosis de siembra adecuada y la cepa comercial logró implantarse al inicio del proceso, los perfiles genéticos de los aislados obtenidos durante la fase de fermentación tumultuosa no coincidieron con el de la cepa comercial. Quizá una de las posibles causas sea la escasa adaptación de la LSA a la temperatura del mosto (12.5 °C)

Cierto volumen de uno de los depositos, cuando se encontraba en la etapa de fermentación tumultuosa, se usó para inocular el tanque otro tanque. Según los resultados de implantación obtenidos en el cultivo madre (67 %), la levadura seleccionada no había conseguido imponerse a mitad de fermentación, y tampoco en el pie de cuba obtenido a partir de él (60 %).

En uno de los tanques, la LSA tampoco consiguió implantarse. La razón, es que existio otra cepa autóctona en el mosto/vino que compite con ella durante la fermentación y finalmente consigue imponerse.

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