jueves, 13 de septiembre de 2012

Selección de Levaduras Vínicas en la Denominación de Origen Calificada Rioja


SELECCIÓN DE LEVADURAS VÍNICAS EN LA DENOMINACIÓN DE ORIGEN CALIFICADA RIOJA

Ana Rosa Gutiérrez Viguera
Mra Pilar Santamaría Aquilué
Rosa Mra López Martín
Mra Jesús Sevilla

Se ha seleccionado una levadura de vinificación autóctona de la D.O.C. Rioja, capaz de mantener la tipicidad de los vinos de esta región. La metodología seguida en el proceso ha sido una selección a partir de 245 aislados de la especie Saccharomyces cerevisiae, siguiendo cronológicamente los criterios: factor killer, comportamiento fermentativo en diferentes condiciones y análisis químico y organoléptico de los vinos elaborados.

La utilización de levaduras seleccionadas en vinificación es una técnica enologica utilizada en los últimos años con el fin de controlar la población de levaduras indígenas que tradicionalmente dirigían el proceso, puesto que la población microbiana protagonista de la fermentación alcohólica va a condicionar notablemente la calidad del producto final (Suárez-Lepe, 1990; Strydom, 1985). Este hecho es conocido desde que Pasteur en 1876 afirmara que "el gusto y la calidad del vino dependen en gran parte de la naturaleza específica de las levaduras que se desarrollan durante la fermentación".

A pesar de las ventajas que a priori tiene la utilización de levaduras seleccionadas, en España y también en Rioja, existe cierta reticencia a su utilización sistemática como una técnica enolgica más, debido principalmente a que las levaduras que actualmente se comercializan son foráneas y es bien conocido que las mismas especies aisladas en zonas vitivinícolas alejadas ceden al vino parámetros enológicos, al menos cuantitativamente distintos (Bravo, 1991).

A pesar de esta oposición a introducir microorganismos ajenos a la propia flora indígena, el consumo de levaduras comerciales en la D.O.C. Rioja, se ha duplicado en los últimos cinco años. De ahí surgió la necesidad desde nuestro punto de vista, de disponer de levaduras seleccionadas originarias de la D.O.C. Rioja que puedan utilizarse cuando los enólogos crean oportuno y de este modo eliminar el temor de uniformización de la flora fermentativa en las distintas zonas productoras.

La selección de cepas o selección clonal se basa en el aislamiento de un número elevado de cultivos puros, que una vez caracterizados taxonómicamente, se estudian desde el punto de vista enologico. Según Vezinhet y Pineau (1990), el criterio a la hora de seleccionar una levadura es que ésta se adapte a la materia prima original, a las condiciones tecnológicas disponibles y a las características del producto final que queremos obtener.

Las metodologías seguidas en los procesos de selección atienden a criterios diversos que pueden ser generales o específicos de determinadas regiones vitivinícolas (Parish y Carroll, 1987; Caillet, 1991). Distintos autores proponen esquemas que estudian con mayor o menor interés determinados parámetros (Delteil, 1990; Suárez Lepe, 1990; Gaia, 1992; Delfini,1992).

1. MATERIALES Y MÉTODOS

- Levaduras:
partimos de 245 cultivos puros de la especie Saccharomyces cerevisiae aislados en las distintas zonas de la D.O.C. Rioja.
- Análisis físico-químico de mostos y vinos: se siguieron los métodos oficiales de análisis de la CEE aplicables al sector del vino (Diario oficial de la CEE, 1990), excepto para el ácido tartárico (método colorimétrico de Rebelein; Lipka y Tanner, 1974), y ácido màlico, ácido láctico, glicerol, ácido succínico y etanal (métodos enzimáticos de la firma Bohéringer Manheim).
- Análisis organoléptico: se siguió la ficha de cata propuesta por el Instituto Nacional de Denominaciones de Origen (INDO).
- Poder floculante: se utilizó el Test de Helm (Caillet, 1991).
- Producción de ácido sulfhídrico: se analizó sembrando sobre agar sulfito de bismuto (Delfini y Bardi, 1990), y por análisis organoléptico.
- Velocidad de fermentación: se calculó según indican Houtman y Du Plessis (1980).
- Formación de espuma: se analizó según describe Vezinhet (1989), pero modificado de acuerdo a las consideraciones realizadas por Bagot y col. (1989).
- Determinación del fenotipo killer: siguiendo la metodología descrita por Bussey (1981) e Hidalgo (1989).
- Análisis aromático de los vinos: por cromatografía de gases (Gutiérrez, 1994).
- Vinificaciones: a lo largo de todo el proceso de selección se realizaron dos tipos de ensayos de fermentación: microvinificaciones sobre mosto sintético (glucosa 20%; KH2PO4 0,5%; (NH4)2 SO4 0,2%; MgS04-7H20 0,04%; Extracto de levadura 0,1%) y microvinifícación sobre 5 litros de mosto de uva.

2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los criterios utilizados cronológicamente en la selección de cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae fueron los siguientes:
- Factor killer
- Comportamiento fermentativo en diferentes condiciones
- Análisis químico y organoléptico de los vinos producidos

2.1. Fenotipo killer

Atendiendo a esta propiedad, las levaduras pueden clasificarse en tres fenotipos distintos: killer, sensibles y neutras. Las levaduras fenotipo killer sintetizan y excretan al medio una toxina (factor killer) que es letal para las células sensibles. Las levaduras con fenotipo neutro no la sintetizan pero son resistentes a su acción. Las levaduras de fenotipo sensible no sintetizan la toxina ni son resistentes a la misma por lo que son destruidas por las cepas killer.

El factor killer juega un importante papel en la concurrencia entre cepas durante la fermentación alcohólica (Tiourina et al., 1980; Rossini, 1985; Petering et al., 1991). El hecho de que la cepa inoculada posea fenotipo killer le confiere una ventaja importante sobre la flora indígena (Radler, 1980; Hidalgo, 1992). Por ello se eligió como primer factor de selección la producción y resistencia al factor killer. El fenotipo dominante entre las cepas en proceso de selección es el neutro.
Como resultado de esta primera etapa de selección eliminamos para la siguiente fase todos los aislados que poseían fenotipo sensible.

2.2.Comportamiento fermentativo

2.2.1. Preselección sobre cepas neutras

Antes de abordar la segunda etapa de selección, y dada la imposibilidad material de seguir trabajando con las 11 cepas killer y las 208 cepas neutras, pasamos por una etapa previa de preselección sobre levaduras con fenotipo neutro.

A pesar de que hubiera parecido lógico que en la segunda fase de selección sólo se incluyeran las cepas killer, el hecho de que el fenotipo dominante fuera el neutro, nos indujo  a no eliminar las 208 cepas que poseían este fenotipo. Además una cepa neutra es resistente a la acción de cepas salvajes killer y esto hace que no se encuentre en situación tan desfavorable como una cepa sensible.

Esta preselección se llevó a cabo mediante la realización de microfermentaciones sobre mosto sintético estéril con cada una de las cepas neutras. El análisis químico de estos vinos se utilizó como criterio discriminador en función de una serie de pautas de evidente interés enològico.

Entre los clones restantes que habían desarrollado fermentaciones normales, elegimos los nueve que mostraron mejor comportamiento: cuatro aislados caracterizados como variedad bayanus, por su facilidad de adaptación a medios donde exista etanol (Gerland y Vallart, 1993), y los cinco clones que produjeron mayor grado alcohólico, puesto que en nuestra Denominación de Origen hay zonas donde el mosto habitual mente posee un elevado grado alcohólico potencial, y para que la fermentación de estos mostos sea correcta son necesarias levaduras capaces de transformar totalmente los azúcares y en consecuencia producir grados alcohólicos altos.

Tras llevar a cabo la primera selección según el factor killer y la preselección sobre cepas neutras, el grupo de clones a estudiar quedó definitivamente compuesto por 20 aislados cuyo origen y características quedaron expuestos.

2.2.2. Estudio de la capacidad floculante

Se estudió mediante el test de Helm. En base a esta característica no pudimos eliminar ninguna de las 20 cepas puesto que todas poseen crecimiento disperso, característica necesaria para conseguir una masa fermentativa homogénea (Parish y Carroll, 1987).

2.2.3. Producción de ácido sulfhídrico

El análisis en placa sobre agar sulfito de bismuto mostró que todas las cepas forman este ácido con mayor o menor intensidad, siendo este resultado acorde con lo reflejado por Suzzi et al. (1975) en relación a que sólo un porcentaje muy bajo de cepas están exentas de generar este ácido.

Sin embargo en el análisis organoléptico de los vinos elaborados en mosto sintético con las 20 cepas, solamente tres mostraban claramente aromas sulfhídricos. Estas 3 muestras, TA.32, SV.71 y 1.55 fueron automáticamente eliminadas del grupo de levaduras en proceso de selección, puesto que la producción de estos compuestos provoca desviaciones aromáticas perjudiciales para la calidad.

2.2.4. Microvinificaciones en matraces de 100 ml

En esta etapa tratamos de estudiar el comportamiento fermentativo y refermentativo de las 17 cepas restantes en diferentes condiciones.

Para el estudio del comportamiento fermentativo se realizarbn tres microvinificaciones diferentes con cada una de las cepas: la primera sobre mosto sintético, la segunda sobre mosto sintético adicionado con 3,3 g/1 de ácido málico y 100 mg/1 de anhídrido sulfuroso, a fin de estudiar la capacidad de degradación del ácido y la adaptación a esos niveles de antiséptico. Y finalmente la tercera microfermentación se realizó sobre mosto de uva esterilizado por filtración.

La capacidad refermentativa de cada cepa se estudió mediante dos ensayos de microfermentación sobre mosto sintético adicionado en la primera prueba con 7% v/v de etanol y la segunda añadiendo el 10%. Estos ensayos se realizaron para estudiar la posibilidad de utilizar estas cepas para refermentar vinos que por cualquier motivo hubieran quedado dulces. En todos los casos, la temperatura de fermentación fue de 20°C.

Los parámetros estudiados en las 5 microfermentaciones fueron: grado alcohólico, pH, acidez total, acidez volátil, ácido tartárico, ácido málico, ácido láctico, azúcares reductores, anhídrido sulfuroso libre y total, altura de espuma formada, glicerol, duración y velocidad de la fermentación.

Como resultado de los datos obtenidos, se seleccionaron las 7 cepas de levadura que mostraron un comportamiento enológico más adecuado y homogéneo en todas las experiencias.

2.3. Análisis químico y organoléptico de los vinos producidos

La fase final de selección sobre los 7 clones restantes se llevó a cabo mediante vinificaciones puras sobre mosto de uva en volúmenes superiores (5 litros), que permitieran un análisis químico exhaustivo de los vinos, así como análisis organoléptico de los mismos.

El mosto obtenido a partir de uvas de la variedad Tempranillo y esterilizado por filtración, tenía las siguientes características analíticas: 193 g/l de azúcares, lo que implica un futuro grado alcohólico aproximado de 11,4% v/v; pH, 3,23; acidez total, 7,41 g/L de ácido tartárico; ácido tartárico, 4,73 g/L; ácido málico, 3,27 g/L; Ó02 libre y total, 33/100 mg/L; y contenido en nitrógeno total de 478,8 mg/1.

3. CONCLUSIONES

Como resultado de todo del estudio, finalmente se selecciono una cepa autóctona Saccharomyces cerevisiae variedad cerevisiae, llamada V.22. Esta cepa posee características fisiológicas y enológicas interesantes que se muestran a continuación: Fenotipo "killer"

No floculante
Baja productora de SH2
Elevada velocidad de fermentación
Buena degradación de azúcares
Baja productora de acidez volátil
No espumógena
Buena capacidad refermentadora
Degrada aproximadamente el 30% del ácido málico en mosto de uva
Producción moderada de glicerol
Producción moderada de alcoholes superiores y etanal

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