miércoles, 10 de octubre de 2012

Nuevo método para detectar alteraciones microbiológicas por levaduras en vinos de crianza


NUEVO MÉTODO PARA DETECTAR ALTERACIONES MICROBIOLÓGICAS POR LEVADURAS EN VINOS DE CRIANZA

El brasileño Cauré Portugal ha obtenido el título de doctor con la tesis número 300 de las defendidas en la Universidad de La Rioja. Su trabajo de investigación ‘Detección y caracterización de Brettanomyces bruxellensis y Trigonopsis cantarellii en el contexto enológico’, revela importantes avances para prevenir una de las contaminaciones más comunes que hoy en día puede sufrir el vino en una bodega.

Dirigida por María Fernanda Ruiz Larrea, catedrática de Bioquímica y Biología Molecular de la UR, la tesis estudia la Brettanomyces bruxellensis, una levadura que está presente y puede manifestarse en todas las fases de producción del vino siendo la principal causa de alteraciones microbiológicas, especialmente en tintos sometidos a procesos de crianza en barrica.

La Brettanomyces bruxellensis, en términos biológicos, es una levadura oportunista: encuentra su hábitat cuando no tiene competencia y cuando otras especies de levaduras desaparecen. Pero como mejor se asienta es con las condiciones de crianza y envejecimiento, ya que tiene unas propiedades para descomponer la celobiosa de la madera que le permiten alojarse en las fisuras de la barrica.

Los vinos contaminados por el denominado ‘carácter Brett’ presentan características organolépticas desagradables, con aromas de establo o cuadra, por lo que, sin llegar a ser perjudiciales para la salud, su calidad es prácticamente irrecuperable y no resultan aptos para el consumo.

Así, la Brettanomyces es responsable de importantes cantidades de vino desechadas y pérdidas económicas para bodegueros ya que afecta indistintamente a la producción de cualquier zona vitivinícola del mundo.

El primer objetivo de la investigación fue la puesta a punto de un protocolo con el fin de detectar y cuantificar la levadura en muestras de vino con turbidez mediante la técnica de biología molecular de PCR cuantitativa.

Si bien este protocolo diseñado por Cauré Portugal está descrito para localizar Brettanomyces, su principal ventaja es que tiene aplicación práctica para detectar otras levaduras. Esto supone que cualquier productor con un equipo de PCR cuantitativa podría realizar sus propios controles de calidad de los vinos a nivel microbiológico empleando el protocolo creado por este investigador.

Un segundo objetivo del trabajo consistió en determinar a qué agentes antimicrobianos, cuyo uso es permitido en enología, es sensible la Brettanomyces para con ellos poder combatirla y prevenir su aparición. El estudio determinó que el agente más eficaz fue el metabisulfito potásico (MBP) que, en una concentración de 100 mg/l, evita el crecimiento de la levadura.

A través de otra línea de la investigación se identificaron diferentes especies de levaduras presentes en vinos durante su crianza en barricas de madera y sospechosas de contaminación por análisis sensorial con indicios de cierta desviación aromática. Cabe destacar en este punto la Trigonopsis cantarellii, una especie que, pese a estar identificada, ha llamado la atención por su recurrencia en las muestras analizadas y confirmándose su capacidad de crecer en vinos tintos secos, generar aromas alterantes y su resistencia a métodos antimicrobianos.

Las conclusiones finales de Cauré Portugal serán publicadas por prestigiosas revistas de investigación a nivel internacional como American Journal of Enology and Viticulture y Australian Journal of Grape and Wine Research.

Además, a lo largo de este trabajo se han llevado a cabo dos proyectos de cooperación con Brasil, financiados por la Universidad de La Rioja y el Gobierno de La Rioja, que han tenido como fruto un convenio de colaboración entre la UR y la Universidad Estadual Paulista (UNESP).

PCR CUANTITATIVA

La PCR cuantitativa junto a los chip de ADN son modernas metodologías para el estudio de la expresión génica, aunque otros métodos tradicionales como el Northern blot, si bien, no con tanta precisión, también permiten su abordaje.

La variabilidad que se introduce en la cuantificación y que conlleva a un error en la estima deriva de la integridad de ADN, eficiencia enzimática y otros muchos factores, por lo que se han desarrollado numerosos sistemas de estandarización. Los hay para cuantificar de forma absoluta la expresión génica, pero, de forma más común, se orientan a la cuantificación relativa del gen de estudio respecto de otro, denominado «normalizador», que se selecciona debido a su expresión casi constante; estos genes suelen denominarse, en inglés, house-keeping genes debido a que suelen estar involucrados en funciones básicas en la supervivencia celular, lo cual suele implicar una expresión constitutiva. De este modo, efectuando en cada experimento la medición de los genes de interés y dividiéndolos por la expresión del gen normalizador seleccionado es posible comparar los primeros aún sin conocer en términos absolutos su nivel de expresión. Los genes normalizadores más empleados son aquellos que codifican para las siguientes proteínas: tubulina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina, RNA ribosomales, etc.

La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de el ADN polimerasa.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten en 25 - 40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mínimo de tres etapas: la primero, en torno a los 95 °C, permite la separación de los ácidos nucleicos de doble cadena; el segundo, a una temperatura en torno a los 50-60 °C, permite el alineamiento de los cebadores al ADN molde; el tercero, a 68 - 72 °C, facilita la polimerización por parte de la ADN polimerasa. Debido al pequeño tamaño de los fragmentos amplificados usualmente en este tipo de PCR puede omitirse el último paso, pues la enzima es capaz de amplificar durante la rampa entre la temperatura de alineamiento y la de desnaturalización. Además, algunos termocicladores añaden a cada ciclo unos segundos a otra temperatura, por ejemplo 80 °C, a fin de reducir el ruido por la presencia de dímeros de cebadores cuando se emplea un colorante inespecífico. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros, como: la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos (dNTPs) en la reacción y la temperatura de unión de los cebadores.

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