lunes, 17 de diciembre de 2012

Efecto de la fuerza iónica y del sulfato sobre la agregación térmica de las proteínas de tipo quitinasa y taumatina


EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA Y DEL SULFATO SOBRE LA AGREGACIÓN TÉRMICA DE LAS PROTEÍNAS DE TIPO QUITINASA Y TAUMATINA

Marangon, M.; Sauvage, F. X.; Waters, E. J.; Vernhet, A.; Journal of Agricultural and Food Chemistry 2011 , 59 (6) 2652–2662

Los consumidores desean que los vinos blancos sean claros y trasparentes. Durante el almacenamiento de los vinos, las proteínas de la uva pueden agregarse formando turbideces. Estas proteínas, en particular las proteínas de tipo quitinasa y taumatina (proteínas TL), tienen que ser eliminadas, y esto se hace a través de la adsorción por la bentonita, un tratamiento efectivo pero ineficiente.

Interesa encontrar procesos alternativos, pero para que tengan éxito es necesario comprender en profundidad las causas que provocan la turbidez proteica. En este estudio, se estudió la función desempeñada por la fuerza iónica (I) y el sulfato en la agregación de proteínas TL y quitinasas con el calentamiento.

Las proteínas purificadas se disolvieron en un vino modelo y se analizaron mediante dispersión de luz dinámica. El efecto de (I) sobre la agregación de proteínas se estudió dentro del intervalo 2-500 mM / l.

Con las quitinasas, la agregación se produjo durante el calentamiento con valores de (I) de 100 y 500 mM / l, dependiendo de la isoforma. Esta agregación condujo inmediatamente a la formación de partículas grandes (3 micras, turbidez visible tras el enfriamiento).

La agregación de proteínas TL se observó sólo con un valor de (I) de 500 mM / l; ésta se desarrolló principalmente durante el enfriamiento y dio lugar a la formación de agregados limitados (400 nm) que permanecían invisible.

Con sulfato en el medio, las quitinasas formaron una turbidez visible inmediatamente cuando se aplicó calor, mientras que los agregados de proteínas TL la formaron durante el enfriamiento, pero no en partículas lo suficientemente grandes como para ser visibles a simple vista.

Los datos muestran que los mecanismos de agregación de las proteínas TL y quitinasa son diferentes y están influenciados por (I) y por el contenido iónico del vino modelo.

En las condiciones utilizadas en este estudio, las quitinasas presentaron una mayor tendencia a la formación de turbidez y a la sedimentación que las proteínas TL.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE TIPO QUITINASA Y TAUMATINA EN MOSTOS Y VINOS

Bourse, D. le; Conreux, A.; Villaume, S.; Lameiras, P.; Nuzillard, J. M.; Jeandet, P. ;Analytical and Bioanalytical Chemistry 401 (5, Wine Analysis) 2011, 1545–1553

Las proteínas de tipo quitinasa y taumatina son unas importantes proteínas de la uva ya que tienen una gran influencia en la calidad del vino. La cuantificación de estas proteínas en mostos y vinos, junto con su purificación, es fundamental para el estudio de sus características intrínsecas y del rol exacto que desempeñan en los vinos.

Las principales isoformas de estas dos proteínas procedentes de mostos de uva Chardonnay se purificaron por cromatografía líquida. Dos etapas de cromatografía líquida de proteínas (FLPC) permitieron el fraccionamiento y purificación de las proteínas del mosto, utilizando intercambio catiónico y un medio de interacción hidrofóbico.

Para alcanzar unos niveles de pureza mayores se aplicó una fase adicional de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La evaluación de la fracción se realizó por espectrometría de masa.

Se determinó la pureza de la fracción por HPLC con el fin de detectar la presencia de proteínas contaminantes, mientras que la presencia de contaminantes orgánicos fue determinada por espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN).

Una vez obtenidas las fracciones puras de proteínas tipo quitinasa y taumatina, se construyeron curvas de calibración para ultra-HPLC (UHPLC) y ensayos inmunoenzimáticos (ELISA).

Se realizó por primera vez la cuantificación de estas proteínas en diferentes muestras de mosto y vino con ambas técnicas a través de la comparación con las curvas de calibración de las proteínas purificadas. UHPLC y ELISA mostraron unos resultados consistentes (una desviación menor del 16% para ambas proteínas) y los dos métodos demostraron ofrecer una cuantificación precisa y fiable de las proteínas en campo enológico.

QUITINASA

Las quitinasas son enzimas que degradan la quitina, un polisacárido de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) con enlaces β(1, 4), sobre los cuales actúan, hidrolizándolos. Estas enzimas se encuentran en una gran variedad de organismos, presentándose desde bacterias, virus y hongos, hasta plantas y animales tanto invertebrados como vertebrados, cumpliendo funciones específicas. En hongos las quitinasas cumplen funciones autolíticas, nutricionales y morfogenéticas; en las bacterias cumple papeles en la digestión de quitina para la obtención de energía a partir de ésta; e crustáceos e insectos, las qutinasas participan en los procesos de muda, mientras que en las plantas, actúan en la defensa y desarrollo (Dahiya et al., 2006).

Recientemente las quitinasas han recibido una gran atención debido a las aplicaciones prácticas de estas enzimas en la industria y por tanto las implicaciones económicas de las mismas. Las quitinasas surgen entonces como una herramienta para la producción de sustancias biológicamente activas, donde uno de los puntos de interés dentro de la industria, es el descubrimiento de las propiedades antifúngicas de algunas de estas enzimas. Las quitinasas fúngicas son capaces de degradar paredes celulares fúngicas como también pueden inhibir su crecimiento in vitro, por ejemplo, las quitinasas producidas por Trichoderma harzianumhan inhibido la germinación de esporas así como la elongación de algunas especies de hongos; por este motivo las quitinasas de esta especie de hongo son atractivas para la industria y el biocontrol debido a su función lítica. De la misma forma quitinasas de especies de hongos termófilos como las de Thermomyces lanuginosus también son de gran interés en la industria por su termoestabilidad que facilita algunos procesos industriales.

La actividad antifúngica del quitosano se ha comprobado en diferentes especies de hongos, afectando fundamentalmente el crecimiento micelial, la esporulación, la germinación y la morfología de las hifas y esporas. Recientemente, se ha comenzado a evaluar el efecto de inducción de resistencia vegetal producido por este biopolímero natural como respuesta a la infección de microorganismos durante el almacenamiento de las frutas y hortalizas, obteniéndose resultados alentadores relacionados con la reducción de la maceración celular y la producción de hidrolasas antifúngicas que actúan directamente sobre la pared celular del patógeno. El uso del quitosano para el control de las enfermedades postcosecha promete ser una nueva alternativa de conservación de los productos hortícolas durante el almacenamiento sin riesgos ecológicos (quitosano en enfermedades postcosecha).

En la actualidad se conoce un gran variedad de genes fúngicos que codifican para quitinasas gracias a que éstos se han aislado y analizado, o también porque se ha completado la secuencia de genomas de especies como Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Coccidioides immitis, Neurospora crassa, Gibberella zeae, Magnaporthe grisea, Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei, entre otros. La mayoría de las quitinasas fúngicas pertenecen a la familia 18 la cual se caracteriza por tener una estructura con cinco dominios: una región con péptido señal N-terminal, un dominio catalítico, región rica en serina/treonina, dominio de unión a quitina y región C-terminal. Sin embargo estos tres últimos dominios pueden estar ausentes y la actividad enzimática de la quitina no es perjudicada.

Nucleótidos: La quitinasas de la Saccharomyces cerevisiae descrita por Correa et al. (1982), han sido clonadas y secuenciadas. Análisis de la secuencia de aminoácidos sugieren que la proteína contiene cuatro dominios: una secuencia señal, un dominio catalítico, una región rica en serina/treonina, y u dominio carboxilo-terminal con una alta afinidad de capturar quitina (Kuranda & Robbins, 1991).

El análisis de microarray de S. cerevisiae expuestos a 5-fluorocytosine, un inhibidor de la síntesis del ADN, también identificado en la regulación de CTS1 (Benton et al., 2006).

TAUMATINA

Taumatina es el edulcorante natural más poderoso conocido. Es denominado en la legislacion alimenticia con el código de identificación E 957.

Es una proteína extraída de los arilos del katemfe (Thaumatococcus), un arbusto de África Occidental. Como todas las proteínas en el organismo se metaboliza como las demás proteínas consumidas en la dieta. Figura en el Libro Guinness de los Récords como la sustancia más dulce conocida, unas 2500 veces más que el azúcar. Tiene un cierto regusto a regaliz, y, mezclada con glutamato, puede utilizarse como potenciador del sabor. Se utiliza en Japón desde 1979. Está autorizada como edulcorante en la Unión Europea. En Inglaterra está autorizada para endulzar medicinas, en EEUU para el chicle y en Australia como agente aromatizante.

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