martes, 8 de enero de 2013

Brettanomyces: Mitos y Realidades en el Vino



BRETTANOMYCES: MITOS Y REALIDADES EN EL VINO

Fuente: Pascal Chatonnet, Alvin Miranda, y Antonio Palacios
Laboratoire Excell, Parc Innolin, 10 rue du golf, 33700 MERIGNAC, France,. Laboratorio Excell Sudamérica, C/ Magdalena 275, Santiago de Chile, Chile; Laboratorio Excell Ibérica, C/ Planillio N° 12, 26006 Logroño, La Rioja.
Tel. 941-445106, excelliberica@labexcell.com. www.labexcell.com

1.- Introducción
Brettanomyces es una levadura conocida ya desde hace mucho tiempo, pero de forma extensa solo recientemente. Es un concepto que no puede dejar de estar sometido a las modas, polémicas, mitos, contradicciones y correcciones milagrosas que surgen como legiones salvadoras y que contribuyen a complicar enormemente un problema grave, pero tan complejo, que algunos prefieren no creer que existe... La abundancia de información sobre el tema de diversa índole y calidad afecta a su gestión y a la solución del problema Brettanomyces, centrado principalmente en los vinos tintos. Este artículo tiene por objetivo poner el punto sobre los elementos claves que pueden influir significativamente en el desarrollo de este microorganismo en los vinos e identificar las herramientas prácticas y eficaces para el control de su desarrollo.

Es una levadura descubierta inicialmente en la cerveza por Claussen (1905)2 y en la fermentación de mostos (Kufferath, 1921 )2 y finalmente en vinos, por Custer (1940) y por Peynaud y Domercq (1956)3. Esta levadura, que pertenece a la familia de Saccharomycetaceae (tales como Saccharomyces) existe en vinos principalmente a través de la especie bruxellensis sp. Fue descrita originalmente como problemática debido a su capacidad de re-fermentación en vinos dulces y por la interferencia ocasionada durante la fermentación alcohólica de Saccharomyces sp. formando alta cantidad de ácido acético. De hecho, si este problema ya existe con Brettanomyces, la alteración mucho más común y potencialmente más problemática es muy diferente. En efecto, esta levadura es capaz de descarboxilar los ácidos cinámicos naturalmente presentes en uvas y en vino (ácido p-cumárico, ferúlico y cafeico) produciendo los vinil-feno- les, luego reducirlos en etil-fenoles (4-etil-fenol principalmente, 4-etil-guayacol y secundariamente 4-etil catecol) que se acumulan en el vino. Estas moléculas volátiles son olorosas y muy estables, capaces de comunicar el carácter aromático llamado en vino "fenolado", muy característico de lo que finalmente lla¬mamos familiarmente el carácter "Brett". El contenido en precursores de etil-fenoles nunca es un factor limitante, todos los vinos contienen suficiente ácido p-cumárico (el ácido cinámico más abundante) para producir varios miligramos de 4-etil-fenol por litro. Después de varios años de controversia innecesaria y con una capacidad de producción variable en función de las cepas, se ha demostrado (4) que sólo Brettanomyces es capaz de formar en vinos tintos grandes cantidades de etil-fenoles causando el carácter "Brett".

El carácter "fenolado" o "Brett" es relativamente común en vinos tintos y afecta gravemente a las variedades aromáticas más típicas. Es aquí donde principalmente, por no escribir únicamente, que Brettanomyces es un problema grave en la enología. En efecto, si dejamos a Brettanomyces que evolucione de forma natural en los vinos, ya sea de Burdeos, California, Sudáfrica, Merlot, Syrah o Tempranillo, al final todos tendrían el mismo aroma! Adiós a la tipología varietal y a la identidad geográfica. Dicho esto, en cuestión de vinos, lo más importante se centra en los estilos y gustos diferenciados que podemos encontrar en el mercado. Algunos productores y aficionados aprecian o buscan este tipo de sabor, no importa, ya se invocó hace tiempo a la "tipicidad" del famoso "terroir" o de la variedad de uva para explicar el olor de "cuero" y "de orina del caballo" que exhalan estos vinos: pero esto es el pasado y es sólo el olor de Brettanomyces....

No existen estadísticas fiables sobre la frecuencia de carácter "Brett" en vinos. Sin embargo, sólo los vinos tintos, veremos por qué más adelante, se ven afectados por este problema. Un análisis realizado hace algún tiempo en un gran número de botellas (5) en el mercado ha mostrado que aproximadamente un tercio estaban afectadas por un defecto potencialmente detectable en la degustación (con una concentración de etil-fenol por enci¬ma del umbral de percepción en el vino tinto, que es más de 600 μ /L para la mezcla de 4-etil-fenol/4-etil-guaiacol (en una proporción de 8:1 observada en mayor frecuencia). Parece que la proporción es ahora más importante y que algunas regiones están más afectadas que otras... Por lo tanto, parece necesario revisar los mitos y realidades en torno a este sujeto para aportar soluciones prácticas a aquellos que deseen verdaderamente dominar la contaminación en cuestión.


Como ejemplo práctico y real, en el gráfico se muestra la representación de 13 vinos de la variedad Tempranillo 2008 con crianza en madera catados a ciegas por 4 expertos en análisis sensorial de carácter internacional mediante evaluación hedónica. Se representan sus puntuaciones frente a las unidades olfativas calculadas según la concentración de etil-fenoles en relación a su umbral de percepción. Como se puede observar, parece que para obtener una alta valoración cualitativa del vino si es necesario mantener una concentración baja de etil-fenoles, sin embargo, su ausencia o baja concentración, no garantiza el éxito. Por esta última razón el coeficiente de correlación de la recta no es muy elevado.

2.- Ecología y origen de Brettanomyces en los vinos
Este problema fundamental ha sido, desgraciadamente, tratado de forma polémica en los últimos años, provocando muchos malentendidos y confusiones entre los profesionales. En primer lugar, el microorganismo ha sido descrito como una "infección por levaduras", un término que sugiere que su presencia se produce solo en vinos anormales o excepcionales, lo que no es del todo razonable o cierto. De hecho, esta levadura está presente en todos los ambientes fermentativos o casi, vino incluido. Entonces, varios estudios se han esforzado para demostrar que las uvas vienen ya repletas de Brettanomyces, para sugerir que es la viña el origen principal de la fuente de "contaminación". Obviamente, Brettanomyces no ha llegado de Marte en una nave espacial o incluso en un meteorito. Sin embargo, todos los estudios ecológicos dejan claro que la frecuencia de detección de esta levadura en la uva es baja o muy baja (0-3 % de las levaduras presentes en uva) en la gran mayoría de los casos. Es sólo en configuraciones específicas, es decir (I) uva más o menos alterada con pérdida de la integridad de su película (6), o (II) en el caso de las parcelas posicionadas a favor del viento de las fuentes de contaminación masiva (vertidos de bodegas ela- boradoras o envasadoras) que pueden llegar a tener poblacio¬nes y consiguiente existe la posibilidad de presentarse como un problema para la bodega posteriormente. Estas situaciones poco comunes deben ser identificadas de forma temprana para programar un sulfitado de la cosecha a un nivel mayor de lo normal (7-8 g/hL) y luego realizar una inoculación con un cultivo iniciador masivo conocido para poder controlar la vinificación industrial y evitar las contaminaciones.

Pero en otras situaciones, ¿cuál es la fuente de contaminación por Brettanomyces? Bueno, como todos los microorganismos responsables de la transformación de la uva en vino: pueden ser los equipos de bodega! Sin embargo, Brettanomyces está muy poco presente o ausente, debido a que la microbiota del proceso fermentativo, levaduras fermentativas y bacterias lácticas, normalmente se multiplican más rápidamente que ella. Sin embargo, las características de su metabolismo y la capacidad de adaptación a las condiciones difíciles, como en el caso de Paradas o accidentes en la ralentización de la cinética fermentativa, donde rápidamente pueden colonizar el medio y luego Producir diferentes alteraciones.

Comenzamos explicando el mayor desarrollo observado en ocasiones en barricas de roble nuevas (8), en sospecha por algunos enólogos como una fuente de contaminación potencial de ,0S v'nos al fomentar el crecimiento de Brettanomyces desde un Punto de vista técnico. De hecho, no es así! La explicación es muV diferente. En primer lugar, Brettanomyces no es parte de la Microbiota normal de la madera. Además, las barricas se calientan en su fabricación entre 150 y 230 °C, lo que conduce a su esterilización si es que estuviesen contaminadas... La cantidad de azúcares asimilables por Brettanomyces liberados por la madera nueva es sólo una cantidad pequeña comparada con la que existe ya de forma natural en los vinos (2). Las barricas viejas siguen siendo una fuente mucho más importante de contaminación que las nuevas, ya que contienen potencialmente inoculo y además, pueden contener etil-fenoles en su masa porosa. Sin embargo, con la presencia potencial en el vino inicialmente contaminado (es decir, en casi todos los casos como se explicó anteriormente), y destacando que la cinética de desaparición de dióxido de azufre libre durante la crianza como único antiséptico activo, es más rápida en barricas nuevas que en las usadas (potencial oxidativo más elevado, mayor evaporación), resultando entonces activo de forma limitada contra Brettanomyces (véase más adelante). Así, paradójicamente, se deduce que Brettanomyces en algunos casos pueden crecer más rápido en las barricas nuevas que en las viejas, incluso a pesar de presentar un inoculo inicial nulo o mucho más bajo. Entonces, el nivel de dióxido de azufre siempre se debe revisar con más frecuencia en las barricas nuevas, especialmente de forma tem¬prana durante la crianza, para evitar sorpresas desagradables.

3.- ¿Cuáles son los factores y prácticas que influyen más en el desarrollo de Brettanomyces en el vino?
La maceración pre fermentativa es una práctica que a veces se utiliza para la vinificación de vinos tintos con el objetivo de promover la extracción de color y de taninos, disminuyendo la velocidad de la fermentación y obteniendo una fermentación alcohólica más regular. Esta práctica se considera en algunas ocasiones un riesgo, pero esta afirmación no es exacta si la técnica se realiza correctamente. En primer lugar, como se mencionó anteriormente, Brettanomyces no forma parte o muy poco de la microbiota natural de la uva y menos aún, si el sulfitado se ha realizado correctamente para llevar a cabo esta práctica (> 5 g/hL). Entonces, a no ser que el mosto está infectado de forma temprana (en uvas alteradas o contaminadas por la bodega), la población de Brettanomyces no es detectable o se encuentra en minoría (de 5 a 10 % de la microbiota formada por levaduras) a los 5 días de maceración, que ya es mucho tiempo o al menos excesivo (11). Pero si ella se encuentra en esta población, entonces perdurará! La realización de maceración en frío inicial impone utilizar uva sana suficientemente sulfitada y enfriada a una temperatura adecuada

( < 10 °C ). En estas condiciones no hay riesgo de contaminación. Además es aconsejable no manipular la uva por bombeo (para evitar la contaminación a través del material de bodega) y no pasar de 5 días como tiempo máximo, para así evitar cualquier riesgo de contaminación inesperada. Cualquier accidente encontrado en el flujo de trabajo del proceso de fermentación representa una oportunidad para el desarrollo de Brettanomyces, siendo el microorganismo contaminante oportunista por excelencia. Los casos de contaminación después de una fermentación no son infrecuentes, pero es especialmente importante en el caso de retrasos en el sulfitado después o antes de la fermentación maloláctica, y si ésta presenta una cinética languideciente, el riesgo es más alto. En estos casos, una inoculación temprana de bacterias lácticas es más que recomendable(12), desafortunadamente en la práctica, la eficacia de esta técnica se ve comprometida por las dificultades del medio frente a la óptima implantación de las bacterias inoculadas para hacer frente al problema. Otras alternativas técnicas son posibles,(ver más adelante). 


Los factores ambientales influyen en el metabolismo y en el crecimiento de Brettanomyces/Dekkera sp (13). En cuanto a la composición del vino, el contenido de etanol afecta negativamente en la capacidad de Brettanomyces para crecer, pero no se debe soñar, ya que vinos de hasta 15,5 % de etanol en volumen puede ser alterados por cepas adaptadas a este tipo de entorno! Un aumento del pH facilita enormemente la multiplicación de Brettanomyces. El pH de los vinos blancos y rosados, naturalmente más ácidos (pH < 3,5) normalmente los protege de cualquier desarrollo significativo de Brettanomyces/Dekkera. Por debajo de 15 °C, el crecimiento se desacelera bruscamente. El aumento de la temperatura favorece la multiplicación hasta 32 °C, lo que explica que la frecuencia de contaminación es más baja en invierno y aumenta bruscamente en verano. A continuación, se tiende a pensar que la disminución de la temperatura de las bodegas de crianza muy por debajo de 15 °C reducirá el riesgo de desarrollo de Brettanomyces. Sin embargo, debe recordarse que la pareja etanol/dióxido de azufre molecular en su correcto valor, es lo más eficaz en la limitación de las poblaciones al incrementar significativamente la duración de su fase de Iatence (12). Sin embargo, el contenido de dióxido de azufre molecular depende, para un pH dado, de la cantidad de S02 libre y de la temperatura. Por lo tanto, en gran medida, reducir la temperatura de las bodegas alcanza un límite en su eficacia muy rápidamente... Además, la reducción de la temperatura puede tener otra desventaja (en el caso de acondicionamiento con aire seco artificial, el consumo de vino y la oxidación es mayor, la proporción madera/vino es más importante y la velocidad de evolución del vino además cambia). Por lo tanto, en la práctica, una temperatura comprendida entre 15 y 17 °C es la ideal. Más allá de 20 °C, el riesgo de contaminación aumenta exponencialmente y la vigilancia debe aplicarse en consecuencia al riesgo asumido. A continuación, otros tipos de problemas pueden ocurrir.

El contenido del vino en azúcar residual es otro factor de sensibilidad positiva. El riesgo de contaminación aumenta exponencialmente con el contenido de azúcar residual! Brettanomyces es una levadura capaz de utilizar muchos azúcares diferentes, entre ellos algunos diholosidos como la trealosa, que puede liberarse al final de la fermentación alcohólica a partir de Saccharomyces (sobre todo si la levadura esta bajo condiciones de estrés) y durante la crianza sobre lías. Una cantidad residual de azúcares (glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa, sacarosa, trealosa) inferior a 0,35 g/L puede ser suficiente para permitir el desarrollo de una población (1.000 células/mL) capaz de sintetizar un contenido de etil-fenoles igual a su umbral de percepción (450 μ /L). Sin embargo, esta cantidad de azúcar está disponible en una gran mayoría de vinos tintos después de la fermentación alcohólica y malolactica (8). Desde 1 g/L, el riesgo de contaminación aumenta peligrosamente. La calidad y la velocidad de la finalización de los procesos de fermentación y la limitación de los recursos energéticos disponibles, son los principales factores de control del riesgo de Bettanomyces. Entonces, debido a la mayor disponibilidad de determinados sustratos procadentes de las lías y su efecto protector frente al dióxido de azufre, la crianza sobre lías en vinos tintos sigue siendo una práctica que indirectamente puede promover el desarrollo de Brettanomyces, por lo que debe reservarse para situaciones saludables y siempre limitadas en el tiempo. Se recomienda entonces una retirada de las lías antes del verano. Además, el seguimiento debe ser lo más riguroso posible, sobre todo si el vino tiene factores de composición favorables (pH > 3,7 en particular).

El roble no es la causa más frecuente de la aparición del carácter "Brett" en vinos envejecidos en barricas. Sin embargo, es evidente que la estructura micro-porosa de la madera es un refugio ideal para los microorganismos en general. Las barricas usadas son una fuente obvia de contaminación; Brettanomyces no solo crece muy bien, como ya hemos citado en las barricas nuevas, sino también en los depósitos de material inerte. Por supuesto, es mucho más fácil limpiar y desinfectar los tanques con una superficie lisa que las barricas o las cubas de madera. Así que la investigación en las técnicas de control de higiene de los recipientes de madera que sean capaces de reducir el riesgo de desarrollo de este microorganismo durante el envejecimiento de los vinos, es completamente necesario llevarla a cabo, (ver más adelante).

Brettanomyces también puede desarrollarse durante el envejecimiento en botellas más o menos al azar (o puede verse afectadas la totalidad de las botellas de un mismo lote). Este microorganismo también ha sido constantemente detectado a partir de vinos viejos embotellados, por lo que reflejan una notable capacidad para sobrevivir en el tiempo. En la mayoría de los casos, las poblaciones son extremadamente bajas antes del embotellado. Debido a su resistencia al dióxido de azufre, las concentraciones usadas en el embotellado no permiten destruir totalmente la levadura residual. Una vez que el contenido de anhídrido sulfuroso libre de la botella ha disminuido lo suficiente (por la oxidación natural), Brettanomyces puede volver a crecer y producir los suficientes fenoles volátiles para causar un daño organoléptico a pesar de partir de una población muy baja. Las condiciones de control y la eliminación de las poblaciones de forma preventiva, especialmente en estado quiescente de Brettanomyces (difícil de detectar) representa un reto importante para garantizar el desarrollo sano de los vinos embotellados, (ver más adelante).

4-. Control preventivo contra Brettanomyces:
- Control de Brettanomyces, lo primero es el viñedo: Esto puede sonar extraño después de lo escrito, pero el factor agronómico influye en gran medida en el riesgo de contaminaciones embarazosas. No porque la fuente de inoculación se encuentra en las uvas, sino debido a que la composición de la uva influye significativamente en la sensibilidad del vino en el desarrollo de Brettanomyces. De hecho, el desequilibrio en la nutrición mineral de la vid, incluyendo el exceso de potasio, conduce inevitablemente a un aumento del pH de los mostos y vinos. En algunos casos, si la acidez no se corrige a tiempo, será imposible utilizar el sulfuroso para inhibir el crecimiento de Brettanomyces. Por el contrario, la falta de fertilización con nitrógeno, por ejemplo, la excesiva competencia (mal control de malas hierbas) o el estrés hídrico excesivo (baja reserva en agua del suelo o riego mal manejado), puede producir uvas difíciles de fermentar. Sin suplementos correctivos en bodega, las uvas experimentarán una fermentación lenta o encontraremos situaciones de fermentaciones incompletas, ideales para promover el desarrollo de Brettanomyces a corto o medio plazo. Por lo tanto, no puede haber expresión del "terroir" naturalmente en estos casos donde se favorece el desarrollo de este germen. Es responsabilidad del enólogo y el bodeguero en especial, corregir o prevenir estas situaciones para así evitar los fenómenos de desequilibrios negativos posteriormente en el vino.

- Utilización de la sulfitación: El dióxido de azufre es el único antiséptico autorizado en el vino, pero Brettanomyes/Dekkera es relativamente resistente a este antiséptico. El contenido de dióxido de azufre molecular activo, el único que tiene propiedades antisépticas, depende principalmente del contenido de dióxido de azufre libre y del pH (0,2 unidades de pH equivale a + 50 % S02 activo); en segundo lugar, de la temperatura (1°C = 7 % de S02 activo) y del contenido en etanol del vino (1 % vol. = 5 % S02 activo). Una concentración de dióxido de azufre acti¬vo molecular de 0,5 mg/L es suficiente para inhibir la proliferación sin impedirla completamente. De 0,7 a 0,8 mg/L, el contenido se convierte en letal si la temperatura es suficientemente alta. Así, si un nivel de 25 mg/L es suficiente para controlar el desarrollo de Brettanomyces a pH 3,60, se necesitará al menos 35 mg/L a un pH de 3,75 y aproximadamente 60 mg/L a pH 3, 90... Por tanto, es claro que el uso de sulfuroso está severamente limitado por la acidez real de vino, este parámetro representa un elemento clave de la "resistencia natural" del vino frente a la contaminación por este tipo de germen. El sulfitado del vino criado en barricas nuevas debe ser aún más cuidadoso, ya que la estabilidad de dióxido de azufre en estas condiciones es mucho más aleatorio. El tapón en posición lateral durante las crianzas prolongadas, la ausencia de relleno como pretexto de utilizar tapones de silicona más estancos, la reducción de la dosis de dióxido de azufre o la ausencia de trasiegos regulares para limitar el trabajo en la bodega, son todos factores que han causado una explosión de contaminaciones en bodega en los últimos años. Por último, siempre hay que considerar el sulfitado del vino como una herramienta de lucha preventiva y no como un tratamiento curativo.

- Mechado de barricas: El mechado de las barricas después de su limpieza mediante combustión de azufre es una práctica a menudo abandonada a causa de su incomodidad, e incluso recientemente puesta en duda en términos legales. Sin embargo, la acción del dióxido de azufre gaseoso es particularmente interesante para la desinfección de la superficie y de los primeros escasos milímetros de las duelas de las barriques9. La práctica del mechado ha demostrado su eficacia en la prevención de la contaminación por Brettanomyces cuando otros medios de desinfección (especialmente el vapor) no están disponibles en bodega. Su sustitución por técnicas alternativas, tales como lavado con agua ozonizada, está en estudio para verificar si puede o no producir exactamente el mismo resultado debido a la acción, en parte superficial, del componente activo. Entre los tratamientos físicos alternativos, incluyendo los físicos, no hay una solución con la sencillez, la productividad, la eficiencia y el costo competitivo como el mechado básico... Por tanto, se espera que esta práctica siga existiendo, incluso por un tiempo ilimitado si fuese posible.

- La higiene y la desinfección de equipos de bodega: Los equipos de bodega y los depósitos vinarios representan el principal reservorio de Brettanomyces en el vino. Es a partir de estos reservorios que la contaminación, limitada a un lote de vino en el inicio, puede ser ampliada a discreción hacia todo el volumen a partir de los movimientos de los vinos y el uso de los equipos de bodega. La desinfección de los mismos es crucial para el control de estos gérmenes, pero ninguna desinfección es efectiva salvo después de una limpieza suficiente. La situación es más complicada en la madera, que tiene un área de desarrollo mucho mayor que el acero inoxidable o la resina epoxi. Además, este material es delicado y los procedimientos de limpieza y desinfección no debe degradarla. Se dedicó ai tema una publicación especial y se remite a los lectores a su consulta para obtener toda la información necesaria (1).

- Coinoculación levaduras/bacterias lácticas: a pesar de todos los avances en el control de la fermentación maloláctica, siguen existiendo problemas en su inducción en algunos vinos. La presencia de alcohol y de otros compuestos tóxicos para las bacterias lácticas que son productos de la FA, el pH bajo y la competencia con levaduras, hacen del vino un medio hostil para los cultivos iniciadores. Desde el principio se consideró que la adición de bacterias lácticas antes de la finalización de la fermentación alcohólica representa un riesgo para que las bacterias degraden azúcares y provoque el nombrado picado láctico. Algunos autores (Beelman y Kunkee, 1985; King y Beelman, 1986) han realizado estudios que demuestran que la coinoculación de las BL con levaduras no sólo no implica antagonismo entre ellas, sino que incluso las bacterias lácticas se aclimatan mejor. La ausencia de etanol y el contenido en nutrientes del mosto, consiguen que la población de bacterias lácticas se aclimate mejor al medio y la fermentación maloláctica se desarrolla mejor, impidiendo además el desarrollo de Brettanomyces entre ambas fermentaciones, por lo que empieza a ser una práctica cada vez más popular en bodega aunque solo sea por esta razón.

5.- Control curativo frente a Brettanomyces:
- Tratamientos físicos térmicos: El tratamiento térmico de vino también llamado flash pasteurización, es una técnica eficaz para la destrucción de todos los tipos de microorganismos. Las condiciones de procesamiento deben adaptarse a las características de resistencia de cada uno. Las características de destrucción térmica de Brettanomyces son conocidas y dependen de las condiciones ambientales. El tiempo de reducción decimal (R.D.) es de 0,3 a 0,4 min. a 55 °C cualquiera que sea el estado fisiológico de las células, el factor Z, que reduce la temperatura de muerte (D.T.) por 10, es de 5 °C. Estos parámetros también se pueden aplicar a la desinfección térmica de barricas. Pero una vez tratado, hay que considerar que el vino puede contaminarse de nuevo con facilidad. Además, el calentamiento del vino durante unos segundos, seguido de su enfriamiento, debe hacerse perfectamente libre de aire para no causar una oxidación perjudicial. Este proceso es ventajoso para bloquear un fulgurante desarrollo en los vinos jóvenes, eventualmente dulces y difíciles de filtrar.

- Tratamientos físicos separativos: La filtración es una técnica clásica llevada a cabo para eliminar microorganismos. La calidad del resultado depende de la porosidad de los medios filtrantes, que debe adaptarse a los microorganismos diana. En el caso de Brettanomyces, especialmente al final de la crianza del vino, las células son pequeñas y requieren un filtro con un poro de menos de 1 miera (idealmente menos de 0,65 mieras) si queremos garantizar la eliminación total. Es ridículo pensar que la filtración puede afectar negativamente a la calidad del vino si está bien realizada y bien diseñada. Si la filtración a este nivel de porosidad afecta gravemente a la calidad, es que esta calidad está basada, por su tamaño, en los elementos muy poco estables... De hecho, la colmatación es perjudicial para la calidad, es decir, la filtración sobre presión en un medio de baja porosidad, puede eliminar elementos positivos para la calidad sensorial. Para evitar afectar la calidad del vino adversamente durante la filtración, a menudo es necesario proceder a etapas sucesivas de filtración (3 y 1 mieras), a una pre-filtración, o a un pre tratamiento enzimàtico para evitar la obstrucción del medio y la esterilización del vino16. La medida única de la turbidez no informa sobre la filtrabilidad real del vino. La determinación del índice de colmatación (17) puede ayudar a adaptar la estrategia para preparar el vino antes de su filtración. Por lo tanto, la filtración está especialmente recomendada antes del embotellado, cuando el vino tiene un perfil de riesgo determinado o cuando ha sido detectada la presencia de una población de Brettanomyces durante un control antes de su trasiego, (ver más adelante).

- Otros tratamientos físicos: Se han propuesto y ensayado otros tratamientos físicos, como la esterilización UV (germicida UV-A), que no es adecuado para el tratamiento de vinos tintos debido a la fuerte absorción de la radiación ultravioleta por los polifenoles presentes. El tratamiento de alta presión (destrucción de células más allá de 200 MPa) es ciertamente eficaz, pero extremadamente costoso, sin proporcionar suficiente flujo (tratamiento discontinuo). El tratamiento por electroporacion (perforación de las membranas celulares bajo el efecto de una diferencia de potencial aplicada en una celda en tratamiento continuo) también tiene cierta eficacia1, pero de nuevo, la falta de equipamiento disponible y los altos costes de procesamiento, limitan significativamente el valor práctico de esta tecnología actualmente.

- Utilización del Chitosano: El Chitosano es un polímero natural de N-acetilglucosamina, derivado de la chitina desacetilada química o enzimáticamente. La chitina se encuentra especialmente en los caparazones de los crustáceos, cefalópodos y en la pared de los hongos filamentosos. El tratamiento de la chitina produce el chitosano. Este polímero debe tener un cierto grado de desacetilación muy especial para ser eficaz vis-a-vis frente a Brettanomyces/Dekkera. El grado de desacetilación del chitosano también afecta a la solubilidad y la viscosidad de la suspensión. Actualmente, sólo el chitosano de origen fúngico, que puede estar acompañado por más o menos (3-glucanos, se permitepor parte de la OIV en vinificación... La principal fuente de chitosano en el mundo, a saber, es la fuente animal, mucho más abundante y menos cara, pero no está sujeto a una aprobación y por lo tanto, está prohibido. Es probable que el potencial alergénico de los crustáceos en contra de los hongos sea el motivo de su "no autorización". Sin embargo, el chitosano de los crustáceos/cefalópodos también se usa ampliamente en la industria de la alimentación y la farmacia sin restricciones... Por tanto, es válido verificar las posibilidades para que el chitosano de origen animal sea permitido en su uso enológico, lo que puede abaratar su utilización. El modo exacto de acción del chitosano es desconocido. Su acción puede deberse a que este polímero catiónico se une a las paredes de Brettanomyces/Dekkera en receptores relativamente específicos (efecto físico) y causa una alteración de la integridad de la membrana (efecto biológico); Saccharomyces sp. o Oenococcus sp. presentes al mismo tiempo, no se ven afectados, por lo que se puede consi¬derar su utilización durante la vinificación en el caso de fermentaciones problemáticas o cuando se sufren retrasos en la finalización de la fermentación maloláctica. Durante la crianza, el chitosano en una dosis de 4 a 6 g/hL puede destruir poblaciones grandes de Brettanomyces en unos pocos días; las células destruidas entonces no pueden formar etil-fenoles. Sin embargo, dado el carácter insoluble del chitosano activo vis-a-vis frente a Brettanomyces, su eficacia suele ser más elevada y posee una mayor duración de la protección en grandes envases que en pequeños contenedores. Su sedimentación es más rápida en las barricas, por lo que puede requerirse una puesta regular en suspensión (agitación) para mantener su actividad. Su tendencia a causar una pequeña desacidificación de los vinos, hay que tenerla en cuenta.

- Utilización de dimetil-dicarbonato (DMDC): Aparte del dióxido de azufre, como el único antiséptico químico utilizado en el vino, se encuentra el dicarbonato de dimetilo. Este producto (Velcorin™) se hidroliza rápidamente en el vino y por lo tanto, es pertinente en la "esterilización en frío" para la sustitución de la filtración o de los tratamientos térmicos antes de ser el vino embotellado. Uno de los productos de hidrólisis, el metanol, limita la dosis máxima utilizable, que no puede exceder para que su concentración no sobrepase la máxima permitida en los vinos tintos (300 mg/L). Este límite de utilización ha sido validado especialmente como alto... Se debe utilizar por lo menos 250 mg/L (lo que representa una liberación de más de 110 mg/L de metanol) para asegurar un buen rendimiento frente a Brettanomyces/Dekkera. También debemos recordar que, por ahora, el uso de DMDC se limita a los vinos que contienen más de 5 g/L de azúcar residual. Su uso está limitado al momento del embotellado, pero esta técnica da excelentes resultados a largo plazo y elimina la necesidad de filtración esterilizante de vinos más difíciles de manejar.

- Utilización de antibióticos: El uso de antibióticos está prohibido desde los orígenes de la reglamentación en la enología. La natamicina o pimaricina, es una toxina anti-hongos producida naturalmente por algunas bacterias del género Streptomyces, sin embargo, figura como un aditivo (E235) utilizado ampliamente en la industria alimentaria (lo que es cierto sólo para el tratamiento externo de algunos quesos y embutidos secos...). A pesar de su eficacia, su uso está totalmente prohibido en el vino. Ha existido una grave crisis ocurrida recientemente en América del Sur (especialmente en Argentina) por el uso incontrolado de este producto. El uso de toxinas killer producidas por levaduras pertenecientes más o menos a la microbiota natural del vino (Kluyveromyces wickerhamii, Pichia anomala) mostró cierta eficacia en los laboratorios que las experimentaron. Otros péptidos (derivados de la lactoferrina bovina) también mostraron una toxicidad vis-a-vis, pero con diferentes eficiencias dependiendo de la cepa. Estas soluciones representan vías interesantes para el control biológico en un futuro quizás próximos.

6-. Tratamiento correctivos para eliminación de etil-fenoles:
- Clarificación del vino: práctica comúnmente usada en bodega para la limpieza del vino. Para ellos e pueden utilizar productos adsorbentes de uso in enología: el PVPP a dosis de 60- 480 mg/L y el carbón enológico de origen vegetal desodorante a dosis de 15-240 mg/L han sido utilizados para eliminar en parte el contenido en fenoles volátiles, si bien, las dosis a emplear para tener resultados significativos, son demasiado elevadas y los efectos colaterales a nivel organoléptico son importantes por su agresividad sobre el vino. También se han empleado polímeros de celulosa, como el acetato y propionato de celulosa, con reducciones del 30%.

- En soluciones modelo el empleo de levaduras secas activas (LSA) como clarificantes han conseguido eliminar proporciones importantes los fenóles volátiles, sin embargo, las dosis para conseguirlo son muy elevadas, lo que encarece la aplicación, además de tener también efectos colaterales sobre la calidad del vino. En esta línea, también se han ensayado cortezas de levaduras específicas con la idea de tener una mayor superficie absorbente, pero los resultados no son muy prometedores por el momento.


- La técnica que parece más eficaz en cuanto a la eliminación selectiva de etil-fenoles es la nanofiltración del vino, donde se puede obtener un permeato con un 35-40% de los etil-fenoles totales del vino y posterior retención en resinas específicas para que estos sean eliminados por retención. A modo de ejemplo mostramos los resultados de una prueba industrial sobre un vino Tempranillo 2009 con crianza en barrica (ver figura). El contenido inicial del vino en etil-fenoles era de 1,4 mg/L, después del tratamiento bajo a 0,81 mg/L gracias a la retención total de dichos compuestos al pasar a través de la resina específica una vez obtenido el permeato con nanofiltración tangencial.

7. Medios de diagnóstico y control del desarrollo de Dekkera/Brettanomyces en el vinos
a) Observación microscópica: es a veces evocada como técnica válida para "identificar" la presencia de Brettanomyces. Por lo tanto, es útil precisar que es totalmente irreal distinguir de forma precisa, y mucho menos identificar finamente, qué tipo de levaduras existen en el vino, ya que no hay tipos morfológicos característicos que no puedan mudar su forma dependiendo de las condiciones físico-químicas del vino! Los que identifican Brettanomyces únicamente mediante observación al microscopio, son en su mayoría víctimas de alucinaciones.

b) Análisis de etil-fenoles: permite diagnosticar con claridad la presencia actual o pasada de Brettanomyces/Dekkera en el vino. Su seguimiento periódico (mensual en verano) durante la crianza permite, del mismo modo que el seguimiento de la evo¬lución de las bacterias acéticas por la determinación de la acidez volátil, seguir el desarrollo de las poblaciones de la levadura contaminante antes de que alcance un umbral crítico. Esta técnica se ha puesto en marcha para controlar el envejecimiento en barricas desde hace varios años (ej: Suivi Brett®), es una técnica simple (tomando una muestra representativa de varias barricas) y rápida (24 horas), lo que fácilmente permite reaccionar proacti va mente en bodega (trasiegos, sulfitado, filtrado o ejecución de acciones más enérgicas) de acuerdo con la intensidad del desarrollo del problema identificado según el cambio de los niveles de fenoles volátiles en el vino.

c) En esta etapa, el control microbiològico es de menos interés. El control microbiològico durante el envejecimiento del vino es mucho más complicado (toma de muestras estériles), es una técnica lenta (5-8 días) y difícil de interpretar si procede de medios de cultivo (ver más adelante). En efecto, porque (I) existen variaciones de una cepa a otra en términos de ajuste de la cinética de crecimiento y (II), las diferencias en la capacidad de producción de etil-fenoles de una cepa a otra1, no existiendo una relación clara entre la población viable y el contenido en fenoles volátiles. En consecuencia, durante la crianza no importa finalmente conocer la población de Brettanomyces/Dekkera, es mejor conocer la concentración y la evolución del contenido de etil-fenoles para poder predecir las consecuencias prácticas en términos de calidad del vino. Esta técnica debe ser generalizada en las bodegas que envejecen vino de alta calidad y tenida en cuenta en un número importante de barricas para evitar desarrollos indeseables.

d) Control y detección de poblaciones de microorganismos en medios de cultivo: El conocimiento de las poblaciones Brettanomyces/Dekkera es una práctica indispensable a realizar antes del embotellado para estimar el riesgo futuro de la desviación en la botella! Es incomprensible que los vinos pueden hoy en día ser acondicionados sin controles microbiológicos. La estimación de la población se puede lograr utilizando diferentes técnicas, pero todas las recogidas de muestras deben realizarse en un vino previamente homogeneizado de cara a Brettanomyces, ya que no es un germen móvil y por lo tanto, tiende a depositarse en el fondo de lo recipientes. Si lo que se desea es únicamente la detección, es mejor no mover el vino y realizar una toma aséptica directamente del fondo de la barrica o del depósito.

El primer método es la enumeración de poblaciones viables obtenidas después de cultivos en medios específicos. Esta metodología tiene tres limitaciones principales. La primera es la especificidad de los llamados medios de cultivo utilizados Resulta que la gran mayoría de los laboratorios y medios de cultivo comercializados hoy en día, no son estrictamente los entornos mas específicos para Brettanomyces/Dekkera. Ellos son (en el mejor de los casos) mas específicos para levaduras Non Saccharomyces (uso de cicloheximída como agente selectivo).

El vino (especialmente aquellos en barricas) puede albergar hongos que crecen en estos medios de cultivo (Pichia sp., Hansenula sp., Zygosaccharomycodes, Hanseniaspora sp.), pero hasta el momento no hay riesgo de producir un carácter "fenol" con estas especies de microorganismos. El uso de estos medios de crecimiento tiene una tendencia a sobreestimar la población de estas especies, a veces muy presentes en los vinos muestreados en barricas. Además, el recuento de células viables en el vino requiere de un período de cultivo de entre 5 y 8 días, tiempo suficiente para desarrollar una alteración si el vino está notablemente contaminado... Por último, la enumeración mediante medios de cultivo no tiene en cuenta "gérmenes viable no cultivable" (VNC), que se corresponden con las células que están en un estado de estrés fisiológico y son incapaces de multiplicarse en un corto plazo de tiempo, considerándolas conjuntamente con las células muertas, cuando en realidad son capaces de multiplicarse en el medio a largo plazo. Los VNC lamentablemente pueden representar a la mayoría (70-90 %) de los microorganismos presentes en los vinos cuando están listos para el embotellado (después de la clarificación, filtración y con los niveles de dióxido de azufre activo ajustados para reducir al mínimo la presencia microbiológica en general). De ello, se deduce que cuando se utiliza la microbiología tradicional existe una subestimación continua del riesgo real. Si se utilizan, deberá al menos, usarse los medios más selectivos posibles (ej: Excell Brett medio selectivo©).

e) Recuento mediante técnicas de biología molecular específicos y rápidos: la técnica mediante PCR cuantitativa sirve para detectar y cuantificar los gérmenes pertenecientes al género Dekkera/Brettanomyces, (Reacción en Cadena de la Polimerasa) en tiempo real (RT-PCR) que permite medir con precisión y sensibilidad (10 células/mL) el número de células presentes según el número de copias de fracciones específicas amplificadas a partir del genoma de la levadura. La detección es simultánea a la amplificación, con resultados casi en tiempo real después de extraer y purificar el contenido de ADN de las células. Los resultados de laboratorio son obtenidos en el día, lo que es extremadamente útil de cara a la bodega. El análisis del contenido de ADN de las células íntegras teóricamente puede medir únicamente las células viables, ya estén en un estado quiescente o no. En la práctica, esta tecnología tiende a sobreestimar ligeramente la población real, ya que lleva de varios días a varias semanas entre la muerte y la pérdida de integridad de la célula y la desaparición total del ADN amplificale. Con la RT- PCR, por lo tanto, se mide el total de las células. Algunos cambios en el protocolo (EMA-RTPCR) antes de la amplificación (intercalación de bromuro de etidio mono-ácido) permiten ahora identificar de forma específica las células reales "viables". Esta técnica (Excell Gen Brett®) es particularmente útil en el control de calidad durante la preparación de vinos a embotellar para poder determinar la eficacia de una estabilización microbiológica y especificar, si es necesario, el medio de filtración óptimo. También controla la eficiencia del proceso en línea antes del final de la construcción de los vinos mediante mezcla y asi poder hacerlo con verdadero conocimiento del riesgo a correr con otros tipos de sondas de ácidos nucleicos, esta misma técnica se puede utilizar para medir (en la misma muestra y ai mismo tiempo) el total de levaduras, ya que algunas de ellas suponen otros posibles tipos de contaminación (por ejemplo, la levadura Zygosaccharomyces bailli), las principales bacterias lácticas contaminantes (Lactobacillus sp. y Pediococcus sp.) y las bacterias acéticas del vino (Acetobacter sp y Gluconobacter).

g) Citometría de flujo es una técnica diseñada para el recuento de células de microorganismos independientemente de su tamaño y estructura (granulometría y densidad) y/o por mareaje con un anticuerpo específico acoplado a un fluorocromo (sin tinción en sentido estricto). El fluorocromo es excitado por un láser que emite fluorescencia medible. Esta técnica es atractiva por su sencillez y velocidad. No obstante, la técnica básica implica generalmente el empleo de una sonda propuesta que no es específica para Brettanomyces/Dekkera. Los promotores de esta tecnología distinguen este tipo de germen de otras levadu¬ras por un criterio de tamaño, suponiendo que las células más pequeña (3 mieras) corresponden a Brettanomyces/Dekkera Se sabe que su forma estándar o tamaño no es muy fiable en las condiciones físico-químicas de los vinos. Los gérmenes VNC pueden tener un tamaño relativamente pequeño, pero también una afinidad por los anticuerpos-fluorocromos baja o por lo menos variable. De ello, se deduce que la tasa de detección en el vino por citometría de flujo de gérmenes sospechosos de ser Brettanomyces es bastante alta (> 200 células/mL) y la especificidad del método muy relativa.

h) Técnicas FISH: el desarrollo de los diferentes reactivos colorantes utilizados en fluorescencia de hibridación in situ con el ADN (FISH), o mejor, el acoplamiento de FISH-Ácido nucleico péptico (PNA-FISH) más sensible y más robusto, permite com probar por epifluorescencia y citometría de flujo (CMF-FlSH) forma muy específica y sensible (100 células/mL) la presencia de contaminantes. En una próxima versión de esta técnica que se está estudiando, se puede distinguir válidamente células vivas de las muertas mediante el acoplamiento de la tinción de ANP-FISH con una coloración específica de las células vivientes con la tecnología Backlight™.

i) Alternativas de diagnóstico cualitativas: el test SNIF BRETT® consiste en un medio de cultivo líquido del vino para la detección de la presencia de Brettanomyces por el aroma de los etil-fenoles después de varios días de incubación, la intensidad relativa de riesgo es inversamente proporcional al tiempo de aparición del olor... Sin embargo, detectar el olor de fenoles volátiles está íntimamente relacionada con la sensibilidad de cada uno y algunas personas realmente no son muy sensibles a este aroma. Además, como ya hemos mencionado anteriormente, no existe una relación estrecha entre la producción de fenoles volátiles y la población de levaduras contaminantes. Por último, el tiempo de respuesta de la prueba es largo. En conclusión, sólo las pruebas positivas permiten llegar a una conclusión, pero entonces ya puede ser demasiado tarde... Un resultado negativo con éste método no concluye con certeza, pero su repetición periódica a corto plazo, puede proporcionar sin embargo algún tipo de vigilancia que es útil en bodega y puede hacer sonar la alarma para intervenir con otras técnicas más finas.

j) Técnicas inmunológicas: la detección de Brettanomyces mediante reacción inmunológica de anticuerpos acoplados a una reacción enzimática coloreada (ELISA) ha sido objeto de varías tentativas. La única fórmula comercial aparentemente todavía disponible (Z-Z-Brett™ para enología) utiliza una banda de fluoruro de polivinilideno impregnado con reactivos inmovilizados en la que se deposita un volumen de vino centrifugado a estudiar. La respuesta se traduce después de la reacción completa con un color más claro o más oscuro que puede estar relacionado cualitativamente con la presencia de Brettanomyces, lo que es una referencia. La prueba es fácil de implementar y lo suficientemente rápida. La sensibilidad se anuncia ambiciosa (10 o 100 células/mL) pero requiere una concentración significativa de la muestra por centrifugación para lograrlo, por lo que no es fácil conseguir una buena reproducibilidad. Además, los anticuerpos son policlonales y en realidad no específicos para Brettanomyces/Dekkera, reaccionan también frente a Zygosaccharomyces sp, Pichia, Candida sp... que están presentes de nuevo en los vinos envejecidos en barricas, lo que hace reaccionar y alterar el resultado mediante la exageración de la respuesta. Esta prueba, por lo tanto, se asemeja más a un método de detección binario positivo/negativo de poblaciones de hecho muy altas (> 1000 células/mL).

8-. Conclusión
El problema Brettanomyces/Dekkera es cada vez más importante en todo el mundo y los elementos básicos que influyen en su desarrollo en los vinos son conocidos desde hace algún tiempo. Sin embargo, tal vez debido a un debate innecesario en los últimos tiempos, la proporción de vinos tintos alterados con un carácter "Brett" se pronuncia claramente en crecimiento. La gestión de Brettanomyces no necesita normalmente una respuesta o métodos de curación sistemáticos y excesivamente complejos. No hay duda, y ciertamente no es necesario tratar de prohibir totalmente en las bodegas a Brettanomyces como microbiota natural, pero sí parece conveniente aprender a manejarla en un nivel seguro en la elaboración de vino de principio a fin.

Para ello, se deben seguir ciertos principios y reglas de sentido común que ahora están documentados científicamente, comenzando así en la viña, que es a menudo subestimada, mal entendida o, peor aún, ignorada y a continuación, llevar a cabo fermentaciones de buena calidad. En medio de todas las herramientas que se ofrecen a los productores y bodegueros para seguir, analizar y diagnosticar en los vinos la presencia de Brettanomyces en las diferentes etapas de su desarrollo, es esencial hacer una buena selección de todas ellas. Una buena profilaxis en la supervisión general y precisa de cada paso, es la clave para utilizar métodos más adecuados en el control completo de un microorganismo muy brillante como oportunista y que parece adecuarse perfectamente a las condiciones del vino. El mínimo error o relajarse, promueve que Brettanomyces/Dekkera siempre esté ahí para llenar un vacío que la naturaleza aborrece!

Referencias bibliográficas:
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8 http://www.decanter.com/news/158631 .html
9 CHATONNET P., DUBOURDIEU D., BOIDRON J-N., 1995 The influence of Brettanomyces/Dekkera sp. yeasts and lactic acid bacteria on the ethylphenol content of red wines. Am. J Enol Vitic, 46, 463-468
10 CHATONNET P., BOIDRON J.N., DUBOURDIEU D., 1993 Influence des conditions d'élevage et de sulfitage des vins rou¬ges en barriques sur la teneur en acide acétique et en éthylphé- nols. J Int Vigne Vin, 17, pp 277-298.
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n CHATONNET P. 2010 Nettoyage et désinfection appliquées aux contenants vinaires en bois destinés à la vinification et à l'é¬levage : partie 2/3 : Nécessités, principes et méthodes de désin¬fection du bois au contact du vin. Revue

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