martes, 29 de enero de 2013

Cómo usar levaduras enológicas



CÓMO USAR LEVADURAS ENOLÓGICAS

Prácticamente todas las levaduras enológicas se encuentran disponibles bajo forma de Levaduras Secas Activas. Existen igualmente levaduras inmovilizadas, en inclusión en bolas de alginato. Su principal aplicación enológica es la toma de espuma, la desacidificación de los mostos y de los vinos (en este caso se utiliza la especie Schizosaccharomyces pombe) y la reanudación de la fermentación. Puesto que hasta ahora no se ha extendido el uso de las levaduras en inclusión, en este caso sólo trataremos la puesta en ejecución de las levaduras bajo forma de LSA.

Las LSA contienen menos del 8 % de agua. Antes de ser incorporadas en el mosto, es preciso rehiratarlas para reactivarlas. Esta etapa es primordial y es necesario respetar tres parámetros :

- La duración: 30 a 45 minutos son suficientes para obtener una rehidratación de cerca del 80 % de la célula. En caso de pasarse, la viabilidad de las levaduras ya no está garantizada.

- La temperatura: debe estar comprendida entre 35 y 40 °C. A esta temperatura, la velocidad de rehidratación es rápida manteniéndose la integridad de la membrana plásmica.

- La presión osmótica del medio: ésta debe ser similar a la del citoplasma de las células. Este equilibrio entre la presión osmótica del medio y de las células permite evitar la lisis de las levaduras.

Teniendo en cuenta estas tres precauciones, se puede proponer el siguiente protocolo de rehidratación. Se espolvorean los granulados en 10 veces su peso de agua caliente potable (35 a 40 ºC), cuyo contenido en azúcar ha sido previamente ajustado a 50 g/L mediante la adición de sacarosa. La cantidad de agua empleada para la rehidratación debe ser como máximo de 10 litros por kilogramo de fideo. También, se puede utilizar mosto diluido al cincuenta por ciento con agua caliente, habiendo comprobado al principio su procedencia (higiene). Al cabo de 10 minutos, una primera homogeneización de la levadura es a veces necesaria para obtener una buena suspensión de los granulados. A continuación, se mantiene la preparación sin agitación durante 20 minutos. Durante esta etapa, se forma una pasta que se hincha, las levaduras están entonces listas para ser usadas. En el caso más sencillo, las levaduras se añaden directamente en el depósito en el momento de un remontado diluyendo la levadura en un pequeño volumen de mosto. Se realiza un remontado de homogeneización. Algunos elaboradores prefieren, no obstante, que las levaduras se premultipliquen en una zona localizada y esperan al día siguiente para homogeneizar el depósito. Si la organización del trabajo en bodega lo permite, las levaduras tras ser rehidratadas pueden mezclarse en un pequeño volumen de mosto (5 a 10% del volumen del depósito) a fin de constituir un pie de cuba. En cuanto aparecen los primeros escapes de CO2, se incorpora la levadura en el volumen final a sembrar al cabo de algunas horas. A veces, esta práctica resulta necesaria para adaptar las levaduras a la composición del medio, por ejemplo para impedir los choques térmicos durante la siembra de los mostos procedentes de un desfangado a baja temperatura. Esta etapa es también preconizada para la siembra de los mostos licorosos de podredumbre noble. En efecto, las levaduras industriales son producidas en condiciones donde el contenido en azúcar es bajo con el fin de favorecer su metabolismo aerobio. Su incorporación directa en un mosto muy rico en azúcar causa un estrés osmótico importante y, seguidamente, una desviación de su metabolismo fermentativo (producción importante de acidez volátil). Al arrancar el crecimiento de las levaduras en un medio menos rico en azúcares, mosto licoroso diluido al 50 % o mosto de uva sana, es posible limitar la formación de acidez volátil al inicio de la fermentación alcohólica. Por último, la constitución de un pie de cuba es indispensable en el caso de levaduras de reanudación de fermentación.

Las dosis actuales preconizadas son de 10 a 15 g/hL para sembrar un mosto blanco y de 15 a 20 g/hL un mosto tinto. Sabiendo que los granulados contienen entre 20 a 30.10 9 células viables/g, una dosis de 10 g/hL corresponde a añadir 2.10 6 células/mL en el mosto. Normalmente, esta aportación es suficiente para garantizar la col¬nización del medio por la cepa seleccionada, cuando las condiciones de higiene de la bodega son satisfactorias. Otros factores son determinantes para la implantación de una cepa de levadura. Al comienzo de la vendimia, es más fácil controlar los arranques de fermentación y la implantación de una cepa dada que al final de la campaña. En general, la aportación de levaduras exógenas debe realizarse lo antes posible después de llenar el depósito.

Actualmente, ya se admite que la adición de levaduras de los primeros depósitos influye sobre la microflora de los otros depósitos en el caso de la vinificación en tinto. Si se utiliza una cepa A para inocular el primer depósito, es posible encontrar esta misma cepa en la segunda cuba de forma mayoritaria sin que se haya realizado la incorporación de levadura. Luego, la cepa A sustituye las levaduras indígenas y puede incluso limitar el desarrollo de una eventual cepa B empleada para inocular esta segunda cuba. Este fenómeno no ha sido demostrado para la vinificación en blanco donde varías cepas de levaduras pueden implantarse en diferentes barricas llenadas de un mismo mosto. Las operaciones comunes a varias cubas como los remontados en el caso de la vinificación en tinto explican estas observaciones. El material utilizado es entonces colonizado por las levaduras, contribuyendo a la propagación en los depósitos. Para preservar la microflora de cada depósito y controlar la implantación de las cepas de levaduras seleccionadas, es necesario aclarar las bombas, depósitos y las cañerías con agua caliente durante los remontados diarios. Si el equipamiento lo permite, será preferible reservar una bomba por depósitos y cepa de levadura utilizada.

En resumen, el éxito de la adición de levaduras y de la implantación de la cepa seleccionada es fundón de diferentes parámetros:

- Una rehidratación correctamente realizada, a fin de mantener la viabilidad de las levaduras.
- Las condiciones de higiene: si el mosto ya contiene una flora indígena elevada (> a 10 5- 10 6 células/mL), la competencia es importante entre estas poblaciones ya bien adaptadas a la composición del mosto y a las levaduras exógenas. La competencia entre cepas existe sobretodo referente a la disponibilidad en nutrientes. La tiamina del mosto es degradada en algunas horas cuando las poblaciones indígenas son importantes. Esta competición existe también para el nitrógeno asimilable.
- Las características de la cepa: su tiempo de latencia debe ser corto de manera que, una vez incorporada, la levadura se adapta fácilmente a la composición del mosto e inicia rápidamente su crecimiento. Asimismo es preferible que la cepa sea killer o neutra. Una cepa sensible con un tiempo de latencia largo (2 o 3 días) puede ser rápidamente suplantada por las levaduras indígenas.
- La limpieza sistemática del material empleado durante los remontados en vinificación en tinto.

CONTROL DE LA IMPLANTACIÓN

La simple observación microscópica y el recuento en la cápsula de Petri no son adecúados para identificar la o las cepas de levadura presentes en una muestra de mosto en fermentación. En los años 80, se marcó una cepa de levadura industrial (levadura K1 ICV-INRA) (adquisición de la resistencia a los inhibidores mitocondriales) para poder controlar fácilmente su implantación por simple recuento en cápsula de Petri.

Las técnicas de la biología molecular aportan nuevas herramientas para la caracterización genética de las cepas de levaduras. Se aplican en investigación, para los estudios de taxonomía y de ecología, pero también para el mantenimiento de las colecciones de levaduras, el control de la pureza de los lotes de producción industrial y los controles de implantación durante la siembra de los mostos. Algunos laboratorios ya proponen pruebas genéticas que permiten comprobar en el curso de la fermentación alcohólica la implantación de una cepa de levadura seleccionada. La mayoría de los análisis propuestos emplean el método de la PCR. Los perfiles genéticos son constantes; contrariamente a los perfiles fisiológicos de asimilación o de fermentación de diferentes sustratos, no varían según el tipo de medio utilizado, el momento de muestrear. El material necesario no es ni voluminoso ni caro. El interés de esta técnica para los controles de implantación reside en la rapidez, el poder discriminante y la sensibilidad. Se realiza el análisis sobre biomasa total, obtenida directamente a partir de mosto en fermentación o previamente aislada en cápsula de Petri. La muestra (algunas decenas de mL) debe ser tomada preferentemente en medio de fermentación alcohólica en un recipiente limpio. También es posible realizar este análisis al final de la fermentación, algunos días después de la fecha de sulfitado e incluso a la salida de la fermentación maloláctica. Una vez tomada, la muestra puede conservarse varios días, incluso varias semanas a 4 °C, pero no en el congelador. El análisis se efectúa directamente sobre levaduras enteras, siendo la extracción de ADN facultativa. Se compara el perfil de amplificación obtenido sobre biomasa total con el obtenido para la cepa en cultivo puro.

Cuando los dos perfiles son estrictamente idénticos, se estima el porcentaje de implantación en cerca del 90 %. En caso contrario, la levadura no se ha implantado mayoritariamente, puede estar presente en la muestra además de diferentes cepas indígenas. Los marcadores del peso molecular contienen fragmentos de ADN cuyo tamaño se conocen, permitiendo sobre todo comparar los resultados de un gel de electroforesis con otro. Estos análisis permiten comprobar que la levadura aportada se ha implantado bien en el mosto. Si el control es positivo, se ha realizado correctamente la puesta en ejecución de las LSA y las características organolépticas del vino obtenido son imputables a la levadura seleccionada. Cuando ensayos comparativos de LSA se llevan a cabo en la bodega, es necesario verificar la implantación para una interpretación rigurosa de los resultados analíticos y sensoriales de los vinos obtenidos. Cuando la cepa no se ha implantado, el vinificador puede cuestionarse su itinerario técnico. En caso de dificultad de fermentación, el control de implantación, incluso efectuado tardíamente, permite incriminar o no la cepa de levadura utilizada en el momento de la adición de la levadura y de diagnosticar mejor las causas del incidente.

Por último, el método PCR también sirve para detectar e identificar levaduras de alteración como Brettanomyces o incluso Zygosaccharomyces.

Como complemento del recuento en cápsula de Petri conteniendo un medio específico, el análisis por PCR permite confirmar la identificación en caso de duda.

Fuente: Vigne & Vin. Publications Internationales   

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