miércoles, 30 de enero de 2013

Especies y Selección de las Bacterías Lácticas Durante la Vinificación



ESPECIES Y SELECCIÓN DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS DURANTE LA VINIFICACIÓN

La microflora de las levaduras y bacterias presente en la uva se halla en el depósito de vinificación, en parte o totalmente, según los tratamientos aplicados a la vendimia. En vinificación en tinto, donde la fermentación maloláctica es casi obligatoria, la microflora es particularmente rica y abundante ya que, salvo el sulfitado, la vendimia sufre pocos o ningún otro tratamiento. En vinificación espontánea, esta microflora garantiza el proceso en su totalidad, primero la fermentación alcohólica por parte de las levaduras y después la fermentación maloláctica por parte de las bacterias lácticas. La siembra complementaría ocasionada por el contacto con el equipamiento de la bodega de vinificación no es despreciable sobre todo tras algunos días. Entre sus múltiples objetivos, el sulfitado de la vendimia asegura una primera selección de los microorganismos. Tiene, entre otros objetivos, el de disminuir la población de bacterias lácticas.

A partir del inoculo inicial, se seleccionan géneros y especies de levaduras y de bacterias. La fermentación alcohólica se desencadena rápidamente modificando considerablemente las condiciones del medio. La transformación de componentes del mosto de uva, en particular de los azúcares fermentables, de varios ácidos orgánicos y de aminoácidos, empobrece el medio, que por el contrario se enriquece en etanol, ácidos grasos y otras moléculas tóxicas para las bacterias. La modificación de su entorno provoca en las bacterias lácticas fenómenos de adaptación continuos. Deben utilizar lo mejor posible los sustratos que las levaduras, de crecimiento explosivo, han dejado disponibles. Simultáneamente, tienen que defenderse de la agresividad, cada vez mayor, de los productos del metabolismo de la levadura. La capacidad de las bacterias lácticas para adaptarse progresivamente a las coacciones del medio recurre a numerosos mecanismos celulares muy sofisticados, de los cuales sólo sospechamos la existencia. Estamos lejos de conocer los detalles. En cambio, sabemos con seguridad que esta facultad de tolerar los cambios medioambientales depende de las especies de bacterias e incluso, dentro de una especie, de las cepas.

La microflora láctica del mosto de uva comprende cerca de una decena de especies. Las bacterias entran en competición con las levaduras, pero no tienen ventaja. En cambio, también interactúan entre ellas. Entre todas las especies presentes inicialmente y entre todas las cepas, algunas desaparecen progresivamente: no poseen o no pueden poner en marcha los medios eficaces para sobrevivir. Esto se traduce por un empobrecimiento de la microflora. Al final de la fermentación alcohólica, sólo sobreviven las cepas que poseen los sistemas más eficaces de detoxificación, de utilización de sustratos u otros mecanismos. La mayor parte del tiempo estas cepas pertenecen mayoritariamente a la especie 0. oeni. Los lactobacilos y los pediococos están menos bien representados. No obstante, no han sido todos completa y definitivamente eliminados del medio. Su población es muy inferior a la de 0. oeni, pasando a menudo desapercibida. Probablemente participan poco en la fermentación maloláctica, pero mientras estas bacterias sean viables transforman sustratos del medio.

El fenómeno de selección descrito entre las especies de bacterias, se produce también entre las cepas en el interior de la especie 0, oem. Asi, incluso dentro de la especie, las cepas son muy diferentes en su tolerancia a las dificultades del medio. No todas poseen el mismo equipamiento enzimático ni los mismos sistemas que permiten  el crecimiento o la supervivencia en medio hostil. Durante la fermentación maloláctica varias cepas de 0. oeni intervienen por tumo, algunas de forma más eficaz que otras.

BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO

Las bacterias lácticas son importantes en enologia ya que pueden dar lugar a alteraciones que deprecian la calidad y la aceptación del producto terminado. También son responsables de la fermentación maloláctica. Al terminar la fermentación maloláctica, el vino permanece en contacto con 107 células/ml de bacterias lácticas, lo que indica la gran importancia que tiene la presencia de estas bacterias en todas las fases posteriores de la elaboración de los vinos.

TAXONOMÍA

En los mostos y los vinos se multiplican un número limitado de especies debido a que estos medios son especialmente selectivos por su pH ácido, su composición en elementos nutritivos y, en el caso del vino, debido también a su riqueza en etanol. Pertenecen a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus y Pediococcus. En realidad, Oenococcus es un género de aparición reciente que substituye a Leuconostos oenus.

Estas bacterias pueden ser aisladas del vino en medio de cultivo de Man, Rogosa, Sharpe (MRS). Wibowo et al., (1985) han propuesto modificar este medio añadiendo zumo de uva, zumo de tomate, cisterna, ácido mÁlico y algunos azúcares. Es necesaria la adición de ciclohemixidina (100 ml/l) y de piramicina (50 mg/l) para inhibir el desarrollo de levaduras y hongos. La incubación de los cultivos con nitrógeno, o mejor con CO2, favorece el crecimiento de las colonias. Después de examinar su coloración gram (+) y su catalasa negativa, la identificación se basa fundamentalmente en su morfología celular, cocos o bastones, y su procedimiento metabólico para degradar la glucosa.

LAS PRINCIPALES BACTERIAS LÁCTICAS DE LOS MOSTOS Y LOS VINOS

Géneros - Naturaleza de la fermentación - Especies - Naturaleza del ácido láctico:


- Pediococcus: Homofermentativo: Pc. damnosus L(+)D(-); Pc. parvulus L(+)D(-); Pc. pentosaceus L(+)D(-)
- Leuconostoc: Heterofermentativo: L mesenteroides    DB
- Oenococcus: Heterofermentativo: 0. oeni D(-); Homofermentativo: Lb. mali L(+) ó L(+) D(-); Heterofermentativo: Lb. casei L(+); facultativo: Lb. plantarum L(+)D(-)
- Lactobacillus: Heterofermentativo: Lb. brevis  L(+)D(-); Lb. buchnerí L(+)D(-); Lb. fermentum L(+)D(-); Lb. fructivorans L(+)D(-); Lb. hilgardii L(+)D(-);

Su proceso energético principal es la fermentación láctica; puede realizarse por vía homofermentativa ó bien heterofermentativa. La homofermentación realizada a partir de glucosa, da lugar a la formación de ácido láctico por glicolisis y a la reducción del piruvato en lactato por las lactato-deshidrogenasas L y/o D.

La heterofermentación de la glucosa se realiza a través de las pentosas. Después de la decarboxilación del azúcar en C6, hay una formación intermedia de una pentosa fosfato (xilulosa-5-P) que es escindida por la fosfocetolasa. Por un lado se llega al gliceraldehido-3-fosfato dando piruvato y lactato, y por otro al acetil-fosfato, dando etanol, vía acetaldehido deshidrogenasa y etanol deshidrogenasa. En presencia de un aceptor de coenzimas reducidas (O2 ó fructosa) el enlace éster fosfórico del acetil-fosfato se mantiene y éste es transformado en acetato y ATP por la acetato quinasa .

Hay que señalar que en el mosto de uva, la heterofermentación de la glucosa da lugar además a la formación de ácido acético paralelamente a la reducción de la fructosa en manitol. Las pentosas son fermentadas por las bacterias heterofermentativas y por algunas bacterias homofermentativas (heterofermentativas facultativas) que tienen fosfocetolasa, que es una enzima fundamental para la heterofermentación.

El género Pediococcus tiene una morfología de cocos agrupados en parejas ó en tétradas; estos cocos nunca forman cadenas. El estudio del ARN, 16S, indica que Pe. damnosus y Pe. parvulus tienen más semejanza entre ellos que con Pe. pentosaceus. Desde los puntos de vista filogénico y fisiológico, el género Pediococcus está más próximo a los géneros Lactobacillus y Leuconostoc que otras bacterias lácticas.

Los géneros Leuconostos y Oenococcus se caracterizan por su morfología en cocos agrupados en parejas y más frecuentemente en cadenas. Por heterofermentación producen gas (CO2) y sobre todo ácido D(-) láctico. Debido a su importancia en la elaboración del vino, han sido objeto de estudios taxonómicos muy detallados. Este nuevo género se distingue bastante claramente del género Leuconostoc por su capacidad de desarrollo a pH ácido y ante un 10% de etanol. Esto está confirmado por los estudios de hibridación ADN/ADN y ARN/ADN entre las diferentes especies de Leuconostoc y también por el análisis inmunológico de dos series de enzimas isoñmcionales, la D-lactato deshidrogenasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Los análisis comparativos de las secuencias de ARN ribosomal 16S han indicado la diferenciación de Leuconostoc oenus y otros leuconostoc. Por tanto, recientemente se ha propuesto reclasificar la especie Leuconostoc oenos en el nuevo género Oenococcus, dándole el nombre de especie Oenococcus oeni.

Así, la única especie de Leuconostoc encontrada en enología sería Le. mesenteroides que está en los mostos al principio de la fermentación alcohólica.

El género Lactobacillus tiene forma de bastoncito. Los trabajos de taxonomía molecular han motivado a Kandler y Weiss a mantener una subdivisión en tres grupos en una primera etapa. El grupo I formado por los lactobacilos homo fermentativos estrictos está poco representado en el medio-vino. Se podría citar el Lb. mali agrupado con el Lb. yamanashiensis. El grupo II formado por los lactobacilos heterofermentativos facultativos es más importante y en él están el Lb. plantarum y el Lb. casei. El grupo III agrupa los lactobacilos heterofermentativos tales como Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. formentum, Lb. fructivorans y Lb. hilgardii.

El origen filogénico del género Lactobacillus está ahora bien definido, pero su diversidad genética hace pensar en su revisión y su división en varios géneros. El conjunto de especies encontradas en el medio-vino ha sido clasificado en el grupo filogénico L. casei - Pediococcus por medio del análisis de las secuencias de los ARN, 16 S.

Las colecciones miniatunzadas como API 50 CH facilitan la identificación de las especies a partir de su perfil de fermentación de los diferentes hidratos de carbono. Los métodos modernos de taxonomía molecular permiten actualmente encontrar la caracterización de géneros y especies directamente por hibridación en colonias con la ayuda de una sonda nucleica debidamente elegida.

ECOLOGÍA

Los trabajos realizados suelen tratar sobre la naturaleza de las especies encontradas en las distintas fases de la vinificación, pero tratan poco sobre el desarrollo de las poblaciones.

Las bacterias lácticas están en la uva, pero en menor número que las bacterias acéticas y las levaduras, o sea alrededor de 100 células/gramo.

Se pueden distinguir diferentes fases en la vinificación. En el mosto y al principio de la fermentación hay 10 3 a 10 4 células/ml. la mayoría de las especies existentes en esta fase corresponden a Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus hilgardü, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus damnosus, y en menor número Oenococcus oeni y Lactobacillus brevis. Su número y proporción son variables según el grado de madurez y el estado de la vendimia, ya que de ello depende el sulfitado. A medida que avanza la transformación del vino por las levaduras, la flora microbiana queda reducida en número y variedad; tiene lugar una selección a favor de las cepas más resistentes al alcohol y al pH. Durante la fermentación maloláctica, o sea (en principio) después de la fermentación alcohólica, se aíslan sobre todo cocos heterofermentativos que pertenecen a la especie Oenococcus oeni. La mayoría de autores coinciden en que esta bacteria es la más abundante en los vinos más ácidos. No obstante, otras bacterias como Pediococcus ssp pueden realizar la fermentación maloláctica en los vinos menos ácidos.

Después de la fermentación maloláctica, la supervivencia de las bacterias lácticas dependerá del pH del vino junto con el contenido en etanol y el contenido en S02. Los vinos que tienen un pH superior a 3,5 tienen floras de alteración con Pediococcus y Lactobacillus que alcanzan 108 células/ml. Generalmente Oenococcus oeni muere rápidamente. Los factores principales que influyen en el desarrollo y supervivencia de las bacterias son:
- La composición del vino.
- Los factores relacionados con la vinificación.
- Los antagonismos entre las mismas bacterias.
- Las interacciones de las bacterias lácticas con las levaduras y las bacterias acéticas.

Bibliografía & Fuentes consultadas: Vigne & Vin. (Publications Internationales) y Enología: Fundamentos científicos y tecnológicos (Claude Flanzy)

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