miércoles, 23 de enero de 2013

Microorganismos del Vino



MICROORGANISMOS DEL VINO

La uva en el viñedo, así como el mosto de uva tras varias operaciones previas a la vinificación, son medios naturalmente «contaminados» por una multitud de microorganismos. En la cuba de fermentación, las condiciones del medio cambian rápidamente de las que eran sobre la baya intacta o prensada. De la mezcla de hongos filamentosos, de levaduras y de bacterias de todo tipo presentes en la uva, únicamente un reducido número de microorganismos es capaz de sobrevivir. Los principales factores de esta selección en masa son la acidez y la extrema riqueza en azúcares del medio, y luego la limitación de oxígeno. En poco tiempo, sólo las levaduras y las bacterias subsisten en el mosto, o la vendimia encubada. Sólo algunos géneros y especies hallarán condiciones favorables a su modo de vida.

La fermentación espontánea es el resultado de incalculables transformaciones bioquímicas realizadas por un conjunto microbiano muy diverso a partir de una materia prima de por sí muy compleja. La levadura de vinificación Saccharomyces cerevisiae transforma la única molécula de glucosa en etanol, pero también en glicerol y numerosos otros productos «secundarios». Esta misma levadura emplea al mismo tiempo otros azúcares, varios ácidos orgánicos y aminoácidos. Así pues, una sola levadura en el zumo de uva es responsable de una multitud de reacciones. Pero, al final de la fermentación alcohólica, los productos del metabolismo de varios géneros de levaduras con su especificidad se han acumulado y, parcialmente, las bacterias han contribuido a los cambios. Después, para un vino que sufre la fermentación maloláctica, la situación se renueva: además del ácido málico, se metabolizan numerosos compuestos del vino, pero no siempre del mismo modo, según las bacterias.

Esquemáticamente, a nivel microbiológico, la vinificación es el resultado de metabolismos realizados por todas las levaduras y por todas las bacterias lácticas, y de transformaciones específicas relacionadas con la naturaleza de las levaduras y las bacterias. Así, todas las Saccharomyces cerevisiae forman etanol con rendimientos muy similares, pero algunas producen otros compuestos en cantidad variable. Del mismo modo, todas las bacterias lácticas descarboxilan el ácido málico, pero sólo algunas descarboxilan también aminoácidos. Por supuesto, la calidad del vino obtenida está muy relacionada con la naturaleza de todas estas transformaciones bioquímicas.

CICLO DE DESARROLLO DE LOS MICROORGANISMOS

Cualquiera que sea, un microorganismo vivo utiliza toda su maquinaria celular para multiplicarse. La muestra más común de la viabilidad de un microorganismo es su capacidad de dar células hijas a partir de una célula madre. El ciclo de desarrollo de una levadura o de una bacteria comprende una fase de latencia durante la cual la población no aumenta, pero se adapta a las condiciones del medio. Sigue la fase de crecimiento exponencial donde la multiplicación se realiza a velocidad constante: una célula bacteriana, por ejemplo, se divide en dos células hijas que inmediatamente inician un nuevo ciclo. En un medio no renovado, como es el caso en vinificación, la población aumenta de forma exponencial hasta alcanzar una fase estacionaria. En este estadio, el crecimiento de la población disminuye progresivamente o se para. Las causas son varias, falta de nutrientes, acumulación de moléculas tóxicas o señales poco conocidas relacionadas con la «superpoblación». En este momento, una parte de la población sigue multipiicándose, mientras que otra muere. Por último, llega la fase de decadencia donde se da la muerte de una proporción cada vez mayor de la población y la lisis de las células.

Es para efectuar este ciclo de desarrollo que levaduras y bacterias utilizan los compuestos del mosto de uva y del vino. De éstos, retiran los elementos para la síntesis de sus constituyentes (paredes, membranas, orgánulos intracelulares, cromosomas, etc.) y claro está las enzimas, catalizadores indispensables de todas las etapas. Estas reacciones proporcionan igualmente la energía sin la cual numerosas síntesis claves no serían posibles. La reserva energética de la célula es la molécula de ATP. Cualquier célula viva la contiene; a la muerte de la célula, es rápidamente hidrolizada.

ESTIMACIÓN DE LA POBLACIÓN MICROBIANA

En diferentes etapas de la elaboración del vino y antes de su acondicionamiento, es importante conocer el nivel de la población de levaduras y bacterias. Por ejemplo, durante la vinificación de un vino tinto, cuando la FML tarda en ponerse en marcha. Pero es sobretodo durante la crianza cuando el control microbiológico es útil. Tanto en depósito como en barrica, el vino siempre aloja microorganismos. El sulfitado realizado al final de la vinificación no los elimina a todos.
Además, en el transcurso de los traspasos, o de los trasiegos, las contaminaciones son posibles. Antes del embotellado, para asegurarse que el vino está definitivamente estabilizado de cara a los microorganismos, el recuento es necesario. El resultado permite decidir el tipo de tratamiento eventual necesario aparte del sulftado, de la filtración o del tratamiento mediante calor.

Los métodos de recuento son más o menos rápidos, sensibles e informativos. Por microscopia, se pueden contar levaduras empleando una célula de Malassez o de Thoma. Debido a su tamaño mucho más pequeño, este método es poco aplicable a las bacterias. La coloración mediante reactivos fluorescentes bajo rayos ultravioletas (epifluorescencia) permite contar fácilmente las levaduras y las bacterias viables. La fluorescencia de las células está relacionada con su actividad metabólica, luego con su vitalidad. El recuento se realiza después de haber recogido las células por filtración, de haberlas incubado con un sustrato que hidrolizan. El dispositivo de iluminación mediante una lámpara de UV sobre la superficie de la preparación provoca la fluorescencia de las células que han reaccionado con el sustrato. La filtrabilidad del vino limita el factor de concentración, por otro lado los constituyentes del vino retenidos sobre la membrana pueden entorpecer la observación. Sólo se puede pretender contar las poblaciones superiores a 10 4 cél/ml. Adjuntar al microscopio un módulo programable, que permite observar todos los campos de la preparación, y un analizador de imagen mejora la sensibilidad. La rapidez es la ventaja esencial de este método.

Para contar los microorganismos vivos, lo más habitual es recurrir al recuento de colonias desarrolladas sobre medio nutritivo sólido. Una célula viva, depositada sobre el medio contenido en una cápsula de Petri, incubada a una temperatura y en una atmósfera adecuada, se multiplica. El crecimiento de la población se da en el lugar donde se ha depositado la célula. Las células se acumulan en este punto de modo que tras un cierto número de generaciones se forma una pila, visible a simple vista; se trata de una colonia. En realidad, una colonia también se forma a partir de un agrupamiento de células de levaduras, de cadenas de lactobacilos, de diplococos (2 células), o de tetradas (4 células). Es por esta razón que el resultado de los recuentos por conteo de colonias se expresa en UFC (Unidad Formando Colonia) por unidad de volumen. El método permite contar selectivamente las levaduras totales, las levaduras de no-Saccharomyces, las bacterias lácticas y las bacterias acéticas. Se cultiva la muestra de vino sobre medios hechos selectivos mediante la adjunción de antibióticos y por la incubación en atmósfera controlada. Desde el mosto en plena fermentación hasta el vino pobre en gérmenes, se puede determinar cualquier nivel de población. En efecto, basta concluir o concentrar la muestra. Para el control de «esterilidad » de un vino, se filtra sobre una membrana, que retiene los microorganismos, un volumen de 100 mi, o incluso todo el volumen de una botella tras acondicionamiento. Se deposita la membrana sobre la superficie del medio nutritivo de agar-agar. El tiempo de incubación necesario para el desarrollo de las colonias es de 2-3 días para las levaduras totales, 3-4 días para las bacterias acéticas, 7 días para las levaduras no-Saccharomyces y 10 a 12 días para las bacterias lácticas. La ventaja de este método es su sensibilidad y su especificidad; tiene el inconveniente de necesitar una espera importante para el resultado.

No obstante, es cierto que una parte de la microflora escapa al conteo, ya que todas las células vivas en el vino no están adaptadas al crecimiento en medio de laboratorio. La diferencia entre el contar por epifluorescencia y el recuento de colonias sobre medio sólido se interpreta por la existencia de una microflora viable no cultivable (VNC). Esta parte de la población es todavía activa en el vino, puesto que la epifluorescencia ya no es capaz de crecer sobre medio de laboratorio. Es sobre todo cuando se halla en carencía nutricional o alterada por otras coacciones del medio que esta población adopta el estado VNC en el cual los sistemas biológicos esenciales se mantienen intactos. Si las coacciones se prolongan o se endurecen, al final los microorganismos mueren.


IDENTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS DEL VINO

La capacidad de las levaduras y bacterias de vino de transformar compuestos del medio depende no solamente del nivel total de su población, sino también de la naturaleza de los géneros, las especies y las cepas presentes. Para que las reacciones que efectúan, influyan en la calidad del vino, las variaciones de concentración de las diversas moléculas formadas deben sobrepasar el umbral de sensibilidad. La amplitud de las transformaciones, y por tanto su importancia enológica, está relacionada con el nivel de actividad de los microorganismos. Al no tener el mismo equipamiento enzimático todas las levaduras y bacterias, es importante conocer la especificidad de las cepas presentes. La identificación aporta estos datos. Según la pregunta planteada, o el problema a resolver, se hace a un nivel jerárquico más o menos fino, desde el género hasta la cepa, pasando por la especie.

Los métodos a emplear se adaptan en función de las necesidades. Los análisis convencionales se basan en la observación de caracteres fenotípicos de orden morfológico, fisiológico o metabólico. Los métodos moleculares más recientes utilizan directamente el genoma del microorganismo y determinan todos sus caracteres fenotípicos. En resumen, los métodos convencionales identifican los microorganismos a través de la expresión del genoma, mientras los moleculares apuntan directamente el ADN. Estos últimos son forzosamente más precisos y fiables, ya que no están sometidos a los distintos parámetros que pueden impedir la expresión de una propiedad bioquímica dada a partir de genes correspondientes.

Los métodos convencionales:

Se identifican los microorganismos tras haber sido aislados por cultivo sobre medio de agar nutritivo. A partir de una muestra de vino, es fácil separar las levaduras de las bacterias por adición en el medio de pimaricina para eliminar las levaduras, o de cloranfenicol para eliminar las bacterias. Para distinguir entre levaduras no- Saccharomyces y Saccharomyces es necesario adicionar cicloheximida (actidiona) que tiene por efecto impedir el crecimiento de Saccharomyces.

Por último, para separar las bacterias lácticas de las bacterias acéticas, se añade penicilina al medio. El antibiótico permite solamente el desarrollo de las bacterias acéticas. La incubación se hace en aerobiosis. Sobre cápsulas de Petri incubadas en atmósfera de CO2 y azufre, sólo las bacterias lácticas forman colonias. Se toman estérilmente las colonias, que se vuelven a poner en cultivo líquido para realizar las observaciones precisas. El conjunto de las informaciones sobre los distintos caracteres es utilizado refiriéndose a un manual que cataloga todas las especies y las claves de identificación correspondientes.

- Las levaduras: La observación microscópica permite examinar la forma y el tamaño de las células, la formación de esporas, el modo de reproducción de las levaduras. Cierto número de especies puede ser fácilmente reconocido por la simple observación microscópica de las células en crecimiento. Las levaduras Kloeckera apiculata y Saccharomyces ludwigii se reconocen con facilidad por su forma de limón, denominada levadura apiculada, siendo la primera aproximadamente diez veces más pequeña que la segunda. Candida stellata se caracteriza por una gemación con forma de estrella específica. Contrariamente a la mayoría de las levaduras del vino que se multiplican por gemación, Schizosaccharomyces pombe se diferencia del resto de especies utilizando la escisiparidad para su multiplicación vegetativa.

Las pruebas fisiológicas de fermentación o de asimilación de diferentes sustratos y de resistencia a los antibióticos completan la identificación de las levaduras por observación microscópica. El mercado ofrece tests de identificación como las galerías API 20C (8 pruebas de fermentación, 10 de asimilación y una de resistencia a la cicloheximida) y las galerías API 50 CH (50 sustratos testados en fermentación o en asimilación). Durante mucho tiempo, se han utilizado estas pruebas para distinguir las variedades, en el seno de la especie Saccharomyces cerevisiae. No obstante, los caracteres fisiológicos son extremadamente variables de una cepa a otra dentro de una misma especie. Por otro lado, emplear sólo los caracteres fisiológicos para clasificar las especies plantea el problema de la estabilidad del fenotipo de una cepa dada durante la conservación. Numerosos estudios han mostrado que los perfiles de fermentación pueden variar tras un largo periodo, sobre todo cuando el fenotipo observado depende de un solo gen mutable. Luego, la noción de variedades para la clasificación y la identificación de las levaduras enológicas, ya no es prácticamente utilizada hoy en día por los taxonomistas.

La delimitación interespecífica de las levaduras del vino se basa, desde ahora, en el significado biológico y genético de la noción de especie. Empleando el criterio de base para la delimitación de las especies (o sea la interferfcilidad de las cepas que la componen), se puede identificar las dos principales especies que intervienen en la transformación de la uva en vino: Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces uvarum. Las esporas de la cepa a identificar, obtenidas por vía sexuada, se cruzan con las esporas de una cepa de referencia de las especies S. cerevisiae y S. uvarum. Cuando el cruce da una línea fértil, las dos esporas pertenecen a la misma especie. En caso de esterilidad, las esporas proceden de cepas pertenecientes a especies diferentes. Esta técnica, relativamente sencilla, sigue siendo lenta a poner en marcha para la identificación de un gran número de aislados.

Variedad o raza fisiológica: representa un conjunto de cepas de levaduras que presentan en común propiedades fisiológicas de fermentación o de asimilación de diferentes sustratos. Se trata de un reagrupamiento sin significado biológico. El cruce de dos especies lleva a una descendencia estéril mientras que dos variedades son interfértiles. Hasta ahora, se juntaba el nombre de la variedad (var. «bayanus», uvarum, capensis, chevalieri...) con el de la especie S. cerevisiae para designar las levaduras del vino.

- Las bacterias: La observación microscópica es indispensable. La forma de las células, redondeadas o en bastón, su disposición en cadenas o en tetradas, da una idea del resultado. Si la observación se efectúa después de la tinción según el método de Gram, se distinguen además las bacterias lácticas (Gram + violeta) de las bacterias acéticas (Gram - rosa). Para identificar hasta el nivel de la especie de las bacterias lácticas, es necesario recopilar información sobre la capacidad de fermentar de los azúcares y otros derivados glucidicos, y sobre la naturaleza de los productos formados a partir de la glucosa. La primera parte utiliza las galerías miniaturizadas API (50CH), sobre la cual se realiza una cincuentena de tests simultáneamente. La otra consiste en cultivar las cepas a identificar y en dosificar los ácidos L y D láctico, el ácido acético y el etanol producidos. En este test, la diferencia se refiere al carácter homofermentativo o heterofermentativo de las cepas.

Por último, la cepa es identificada, como coco o lactobacilo por su forma, su carácter homofermentativo o no, y por el espectro de uso de los azúcares y derivados. Los aislados se clasifican entre los géneros Leuconostoc, Pediococcus, Oenococcus o Lactobacillus y varias especies, de las cuales las principales en el vino son:

Lista de las especies de bacterias lácticas más corrientes en el mosto de uva y el vino:

- Bacilo: Lacotabillus plantarum, L. casei (homofermentativo); Lactobacillus hilgardii, L. brevis (heterofermentativo).
- Coco: Pediococus damnosus, P. parvulus (homofermentativo); Leuconostoc mesenteroides; Oenococcus oeni (heterofermentativo).

Las bacterias acéticas se distinguen bastante fácilmente de las bacterias lácticas en las observaciones microscópicas en estado fresco, ya que la mayoría son muy móviles. Pero la tinaón de Gram es mucho más fiable. En el mosto de uva y el vino, sólo predominan tres especies: Gluconobacter oxydans, Acetobacter pasteuríanus y Acetobacter aceti. Su identificación se basa en su capacidad de oxidar el etanol, el glicerol y el ácido láctico. La primera especie sólo oxida el etanol, las dos restantes oxidan, respectivamente, el etanol y el lactato (A pasteuríanus) o los tres sustratos (A aceti).
 
Identificación por métodos moleculares:

El principio de base es identificar las levaduras o las bacterias refiriéndose a su contenido genético, total o parcial. El método recurre a las similitudes de los genomas que definen el grado de parentesco entre las cepas. Así, los genomas de dos cepas de Oenococcus oeni presentan mayor similitud entre ellos que el de un Oenococcus oeni y de un Lactobacillus plantarum, por ejemplo. Es a nivel de la secuencia del genoma que se establecen las comparaciones. Por supuesto, no se trata de analizar la secuencia de los genomas completos. Los métodos analíticos que se basan sobre las diferencias, o similitudes, de las secuencias, permiten las comparaciones. Éstos utilizan cuatro importantes propiedades de la molécula de ADN.

- La molécula de ADN y sus propiedades: El material genético, representado por los cromosomas y los plásmidos (min-cromosomas), está constituido de ADN, un polímero de nucleótidos caracterizados cada uno por una molécula básica adenina (A), citosina (C), timina (T), guanina (G). La molécula de ADN está compuesta por dos «hebras» paralelas de polinucleótidos asonados entre ellos a nivel de las bases mediante uniones hidrógeno débiles: A está unido a T, y G a C. Se denomina secuencia la sucesión de bases sobre la hebra de ADN. Las dos hebras son llamadas «complementarias» debido al aparejamiento de las bases que siempre es respetado: a la secuencia ATGC de una hebra corresponde la secuencia TACG de la hebra opuesta. Se emplean cuatro propiedades de la molécula de ADN para la identificación:

. La capacidad de ser «desnaturalizada»: Las dos hebras paralelas se separan fácilmente por calor: es la desnaturalización. El retorno a la temperatura ambiente permite el reaparejamiento de ambas cadenas. Sobre esta propiedad se basan los métodos de hibridación y el método de PCR. Dos fragmentos de ADN, independientemente de su origen, pueden juntarse si su secuencia nucleotídica es complementaría : es la hibridación.

. Las enzimas, llamadas enzimas de restricción, hidrolizan la cadena nucleotídica en sitios bien específicos para cada una de ellas; la especificidad viene dada por la secuencia a nivel del sitio de corte.

. El ADN puede ser sintetizado in vitro a partir de nucleótidos, por una polimerasa que los junta siguiendo la secuencia complementaria de un ADN llamado matriz. La «Taq polimerasa», enzima termoresistente, está bien adaptada a la PCR que comporta numerosos ciclos sucesivos de polimerización delimitados por saltos de temperatura. Por otra parte, la polimerasa sólo puede funcionar a partir de cebos. Éstos son secuencias cortas de ADN escogidas. Debido a su secuencia, éstas se hibridan al ADN y delimitan la región del genoma que es copiada varios millones de veces. La acumulación de copias hace fácil la visualización de esta región tras electroforesis.

. Las moléculas de ADN están cargadas negativamente en un tampón de electroforesis. En función de su tamaño, migran más o menos hacia el cátodo bajo la acción del campo eléctrico. El ADN es señalado en los geles por tinaón al bromuro de etidium e iluminación bajo UV.

- Identificación de las levaduras: Las primeras tentativas para diferenciar las cepas de S. cerevisiae concernían el estudio de las macromoléculas exocelulares en electroforesis. Pero esta técnica, basada como muchas otras en un simple criterio bioquímico de diferenciación, resulta ser poco discriminante y dificilmente permite la caracterización de las cepas de S. cerevisiae. Además, depende de numerosos parámetros (estado fisiológico de cada célula, condiciones de cultivo, etc.) y obliga a trabajar en condiciones estrictamente controladas y estandarizadas. Las recientes técnicas de la biología molecular, que permiten el análisis directo de la estructura fina del genoma de la levadura, son excelentes herramientas para la caracterización de las especies y de las cepas de S. cerevisiae y de S. uvarum. Los métodos desarrollados para la identificación de las levaduras se basan en el análisis del ADN nuclear o mitocondrial. A menudo, se utiliza el mismo principio para la caracterización de las levaduras a nivel de la especie y de la cepa.

El genoma de la levadura es el más pequeño de todos los genomas eucariotos conocidos: su tamaño es de 12,8 Mb (el del genoma humano es de 3000 Mb). La información genética se halla en los cromosomas, en total 16, pero también en el ADN de las mitocondrias (86Kp) y en los elementos extra-cromosómicos (plásmidos, ARN doble cadena Killer).

Las primeras técnicas de la biología molecular puestas en marcha para la identificación de las levaduras enológicas conciernen el ADN mitocondrial, material elegido por su polimorfismo estructural de una cepa a otra y su estabilidad durante la multiplicación vegetativa. El método consiste en extraer el ADN mitocondrial y aislarlo del ADN nuclear. Una vez cortados por medio de las enzimas de restricción, se separan los fragmentos obtenidos sobre un gel de electroforesis. Este método lleva el nombre de RFLP, Polimorfismo de Tamaño de los Fragmentos de Restricción. El número y el tamaño de los fragmentos de restricción varían de una especie a otra, pero igualmente de una cepa a otra. Estos primeros trabajos han permitido poner de manifiesto la gran diversidad genética que existe entre las distintas cepas enológicas de S. cerevisiae.

Paralelamente, se ha desarrollado el uso de la electroforesis en campo pulsado: los cromosomas de S. cerevisiae o de S. uvarum son moléculas de ADN de tamaño muy grande (200 a 2000 kb), que no pueden ser separados por métodos de electroforesis clásica. La electroforesis a campo pulsado consiste en aplicar un campo eléctrico alternativo, mediante un juego de electrodos colocados a 120° y cuya orientación cambia en el momento de los « pulsos » (aplicación de la corriente eléctrica) de tiempo definido. Las moléculas de ADN sufren un fenómeno de reorientación debido a la posición de los electrodos, las moléculas de tamaño pequeño se reordenan más fácilmente que las de gran tamaño. Resultado de la migración, se obtiene un cariotipo. La diferenciación de las cepas según esta técnica se basa en el poliformismo de tamaño de los cromosomas de la levadura. Aplicada a la enología, la electroforesis en campo pulsado permite la identificación de las especies S. cerevisiae y S. uvarum. En particular, se trata de una herramienta muy discriminante para caracterizar las cepas de S. cerevisiae y S. uvarum en los estudios ecológicos. Su puesta en práctica sigue siendo relativamente lenta (preparación del ADN y migración), y necesita de un material específico caro y de tiempos de migración de 24 a 48 h para separar correctamente los cromosomas.

La caracterización de las levaduras del vino ha recurrido cada vez más a la Reacción de Polimerización en Cadena (PCR). Este método consiste en amplificar vía enzimática in vitro las regiones del genoma de las levaduras que difieren de una cepa a otra (frecuencias de aparición en el genoma, naturaleza de las secuencias). La reacción puede hacerse directamente sobre las células enteras aisladas o en suspensión en el vino. Tras amplificación, los fragmentos obtenidos son directamente separados sobre gel de agarosa o cortados por enzimas de restricción antes de ser analizados por electroforesis. Las secuencias apuntadas para la amplificación se localizan a menudo a nivel de los ADN ribosómieos, región muy usada para los estudios fílogenéticos. Estos métodos son sencillos y rápidos de poner en marcha. Se emplean normalmente para los controles de calidad de lotes de producción industrial de Levaduras Secas Activas, pero también para los controles de implantación de las preparaciones de levaduras en vinificación. La PCR se utiliza asimismo para la detección y la identificación genética de las levaduras de alteración, como las Brettonomyces o las Zygosaccharomyces bailii.

- Identificación de las bacterias

- Identificación a nivel de la especie:

El primer método molecular usado para las bacterias del vino se basaba en la hibridación ADN/ADN. El ADN de las cepas a identificar es depositado y fijado bajo forma de filamento simple desnaturalizado sobre una membrana de nylon. Por otro lado, disponemos de ADN especifico extraído de una cepa de referencia, marcado radioactivamente o por derivados químicos de nucleótidos. Es la sonda de ADN, que puede ser específica de una especie. El ADN total extraído de 0. oeni, luego marcado y desnaturalizado bajo forma de filamento simple, constituye una sonda que solamente se híbrida con depósitos de ADN de cepa de 0. oeni. Varias especies de bacterias del vino pueden ser identificadas de este modo. Cuando se realiza la hibridación sobre ADN procedente de colonias transferidas sobre la membrana por huella, todas las colonias desarrolladas sobre un medio nutritivo sólido pueden ser identificadas. Basta con emplear suevamente todas las sondas de las especies.

La identificación a nivel de la especie tambien puede efectuarse por PCR. los cebadores deben ser específicos, es decir que sólo se hibridan con el ADN de la especie en cuestión. En estas condiciones, la PCR se traduce por la amplificación, o sea la acumulación en el medio de un fragmento de ADN que únicamente existe en esta especie. Por otro lado, se puede identificar cualquier bacteria por amplificación del ADN ribosómico. Para ello, disponemos de cebos «universales» que se hibridan a regiones muy conservadas del ADN ribosómico de todos los procariotas. Como la región amplificada entre los cebadores es variable según las bacterias, la secuenciarión del amplificado permite la identificación refiriéndose a los bancos de genes ribosómicos. Es el método utilizado cuando se pretende identificar sin a priorí.

- Identificación a nivel de la cepa:

El cromosoma bacteriano es hidrolizado por enzimas de restricción cuyo número de sitios de corte es estadísticamente débil. La rareza del sitio depende de la longitud del sitio de la secuencia reconocida. El genoma total de un lactobacilo o de un coco es cortado en 10-15 fragmentos fácilmente separables por electroforesis en campo pulsado. El perfil de hidrólisis del ADN de dos cepas de bacterias de una misma especie es diferente. De este modo, podemos por ejemplo darnos cuenta de la diversidad de las cepas de 0. oeni durante una FML o comprobar la implantación de una levadura maloláctica.

Fuente: Vigne & Vin. Publications Internationales 

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