domingo, 27 de enero de 2013

Selección de las Levaduras y Frabricación Industrial para la Fermentación del Vino



SELECCIÓN DE LAS LEVADURAS Y FABRICACIÓN INDUSTRIAL PARA LA FERMENTACIÓN DEL VINO

Desde hace unos cuarenta años, Los elaboradores pueden utilizar preparaciones de levaduras industríales para realizar la fermentación alcohólica del zumo de uva. Inicialmente acondicionadas como pastas líquidas, las preparaciones de levaduras se presentan hoy en día bajo forma de fideos deshidratados o «Levaduras Activas Secas» (LSA). Sencillo de utilizar, este formato ha contribuido mucho a generalizar la práctica de la adición de levaduras. Si las primeras selecciones de levaduras sólo favorecían el desencadenamiento de las fermentaciones, los progresos realizados estos últimos años hacen reconsiderar este rol puramente fermentativo. Actualmente, los criterios de selección de levaduras se dirigen hacia la elección de cepas susceptibles de conducir a una disminución de los defectos organolépticos y a una expresión más fina de las calidades potenciales de los vinos.

LA SELECCIÓN DE LAS LEVADURAS

Gracias a los nuevos métodos de identificación y a un mayor conocimiento del papel de S. cerevisiae sobre las características organolépticas de los vinos, las estrategias de selección de las levaduras no han parado de evolucionar desde el uso de la primera cepa industrial en los años 70-80. La caracterización molecular de las cepas indígenas de 5. cerevisiae, realizada por numerosos grupos de investigación en el mundo entero, ha mostrado la inmensa diversidad genética que caracteriza las levaduras encontradas durante la fermentación del zumo de uva. Este poliformismo se acompaña de una gran variabilidad de sus propiedades tecnológicas. Asi, la naturaleza constituye una verdadera reserva para la selección de cepas de interés. Hasta hoy, se ha aprovechado este recurso para aislar a partir de la microflora indígena, la mayoría de las levaduras seleccionadas que ofrece el mercado» Otros métodos, como la hibridación o las técnicas de ingeniería genética, permiten mejorar las propiedades tecnológicas.

Las etapas de la selección de las levaduras de interés para la transformación de la uva en vino:

1 Definición de los criterios de selección y de la aplicación
2 Constitución de una colección de cepas. Aislamiento de colonias - colección
3 Identificación génetica de las colonias aisladas (ECP, PCR)
4 Pruebas en microvinificaciones en el laboratorio.
5 Pre-producción industrial. Pruebas en grandes volúmenes en bodega.
6 Producción industrial y comercialización. Depósito en la colección

La constitución de una colección de cepas es la operación previa a la selección de una cepa de levadura de interés enológico. Las muestras se realizan a partir de fermentaciones espontáneas durante la campaña de vendimia. Las bodegas de muestreo no deben haber practicado la adición de levaduras desde hace varios años (5-6). La mayor parte del tiempo, se aíslan las cepas de mostos de características equivalentes y cercanas a las de la futura aplicación de la levadura seleccionada. Por ejemplo, una levadura destinada a la elaboración de vinos tipo Sauternes aislada a partir de mostos ricos en azúcares de podredumbre noble. En condiciones naturales, algunas cepas se han adaptado particularme bien a la composición físico-química del medio circundante. Las colonias salidas de estas muestras se coleccionan y se almacenan en el congelador. Se establece el perfil genético de cada colonia para identificar la especie y las diferentes cepas presentes en la muestra.

A continuación, se realizan las microvinificaciones en el laboratorio en un medio modelo y sobre mosto, para testar las propiedades tecnológicas de los aislados, a menudo en comparación con las de levaduras ya comercializadas. Siguiendo los objetivos de la selección (elaboración de vinos blancos, de vinos tintos, reanudación de la fermentación...), los criterios tomados en cuenta son variables y muy específicos. Primero, está la adaptación de la cepa a la composición del zumo de uva (concentración en azúcares, en ácidos, en compuestos nitrogenados...) y a las condiciones de vinificación (dosis de dióxido de azufre, temperatura de fermentación, nivel de aireación, nivel de clarificación de los zumos blancos y rosados...). Luego viene la ausencia de defectos organolépticos relacionados con el metabolismo fermentativo: producción excesiva de ácido acético, de acetato de etilo, de compuestos azufrados, de alcoholes superiores. Otros criterios, de orden fisiológico, pueden también ser considerados como el factor «killer» de una toxina activa sobre células llamadas «sensibles», Entre la flora indígena, hay levaduras sensibles, neutras y killer, siendo estas últimas mayoritarias. Si la propiedad
killer para una levadura seleccionada constituye un elemento de su implantación en los mostos en presencia de una flora indígena «killer», la aptitud fermentativa de la levadura sigue siendo la baza fundamental de su implantación.

La levadura produce durante la fermentación alcohólica compuestos aromáticos reagrupados bajo el término «aromas fermentativos». Estos compuestos, por ejemplo el acetato de isoamilo con su «famoso» aroma de plátano y de bombón inglés, juegan un rol más o menos importante en el aroma de los vinos jóvenes tipo «primeur» procedentes de variedades relativamente neutras. En las condiciones de fermentación dadas, algunas cepas de levaduras son más aptas que otras para liberar estos compuestos. A lo largo de los años 80, en los criterios de selección, se ha tomado en cuenta la aptitud de estas cepas para producir cantidades importantes de aromas fermentativos. Este tipo de cepa todavía se utiliza mucho en vinificación. Sin embargo, estas moléculas aromáticas son poco estables en el tiempo y cuando se hallan presentes en concentraciones demasiado fuertes, enmascaran la originalidad del aroma varíetal de estas variedades aromáticas.

En la uva, existen compuestos importantes del aroma de los vinos bajo forma de precursores no aromáticos. Su transformación en substancias aromáticas hace intervenir mecanismos químicos o enzimáticos en los cuales puede participar levadura. Los vinil-fenoles poseen un olor farmacéutico y a partir de una cierta concentración desvalorizan la calidad y la finura aromática de los vinos blancos y rosados. Estos compuestos son liberados durante la fermentación alcohólica a partir de ácidos hidroxicinámicos del mosto, bajo la acción de una actividad enzimática descarboxilasa de la levadura (cinamato descarboxilasa). En cervecería, se conoce bien este fenómeno, ya que los contenidos en ácidos fenoles de las maltas son muy importantes, lo que origina graves defectos olfativos conocidos bajo el nombre de phenol-off-flavour (POF). La selección de cepas de levaduras de débil actividad cinamato-descarboxilasa (levaduras POF) permite limitar la formación de vinilfenoles.

Otro criterio de selección es su incidencia sobre el aroma varíetal. Para la variedad Sauvignon, ésta ha sido claramente demostrada. Estos compuestos azufrados olorosos, constituyentes importantes del aroma varíetal de algunas variedades, son liberados a lo largo de la fermentación alcohólica a partir de una forma precursora inodora, las S-conjugadas a la cisteína. Los contenidos de estos compuestos volátiles varían significativamente en los vinos en función de la cepa que ha efectuado la fermentación alcohólica. De una flora indígena (100 aislados) nacida de fermentaciones espontáneas de Sauvignon, es posible aislar una cepa que libere muchos de estos aromas varietales.

Todavía, no se han determinado los criterios selección específicos a la vinificación en tinto. Algunos autores plantean un posible rol de la cepa de levadura sobre ta extracción de la materia colorante, o sobre la estructura de los vinos tintos, pero los fenómenos moleculares no han sido dilucidados. Una aproximación bioquímica de la selección de levaduras para los vinos tintos parece pues prematura. Se ha desarrollado otro paso de naturaleza ecológica. Se han analizado, mediante la técnica del ECP, numerosas muéstras de levaduras realizadas en algunos grand crus de vinos tintos del Bórdeles, que presentaban fermentaciones espontáneas regulares. Se ha mostrado que, en una misma región y en distintos I depósitos, una cepa dominante puede representar del 60 al 70% de las cepas identificadas a lo largo de la fermentación alcohólica. Se ha observado este fenómeno varios años consecutivos, mostrando así la facultad de adaptación de una misma cepa a las condiciones de vinificación y el interés de su selección.

Tras haber analizado un gran número de clones, sólo se retienen, para una eventual producción industrial, uno o dos individuos respondiendo a los distintos criterios de selección. Se necesitan de 3 a 4 años para llevar a cabo una selección de levaduras a partir de la microflora indígena.

Otra estrategia para la obtención rápida de nuevos dones de alta calidad consiste en mejorar una o varias propiedades tecnológicas en las cepas preseleccionadas. El método de cuzamiento o «breeding» se basa en la propiedad de las levaduras Saccharomyces de multiplicarse por vía sexuada.

En el viñedo o en la bodega, las levaduras pueden utilizar la vía sexuada y esporular en se entorno natural. En el laboratorio, se puede hacer esporular varias cepas y aislar su descendencia. Tras digestión de la pared de la asca, se separan las esporas sobre medio sólido con la ayuda de un microscopio provisto de una microaguja (micromanipulador) que permite aislarlas.

El método de Breeding: En condiciones de carencias nutritivas, S. cerevisiae es capaz de esporular y de formar un órgano de supervivencia (asca) que encierra 4 esporas nacidas de la meiosis. Siendo las levaduras del vino heterocigotas, las esporas obtenidas poseen un patrimonio genético diferente entre ellas, pero también distinto del de la cepa madres. La descendencia hereda las características tecnológicas de la cepa madre salvo algunos matices. El cruzamiento de dos esporas de línea parental diferente permite la obtención de un nuevo individuo de características tecnológicas a menudo intermedias de las de los dos parentales.

Los clones de este modo obtenidos, son ensayados para determinar sus características tecnológicas. Se seleccionan directamente como tales o utilizados en los cruzamientos a fin de reagrupar en el seno de una misma célula propiedades tecnológicas de interés.

Por ejemplo el uso del breeding para la mejora de una levadura industrial. La cepa S. cerevisiae VL3c, obtenida de varias etapas de selecdón, fue escogida a partir de una colección de un centenar de aislados por sus características fermentativas y su buena aptitud para transformar los precursores S-conjugados a la cisteína. La cepa P3, S. uvarum, fua aislada en la región del Val de Loire (Franria). Presenta una notable aptitud para liberar los tioles volátiles a partir de su precursor y para formar muy poca acidez volátil. Pero produce fuertes contenidos de feniletanol y su acetato, aroma fermentativo banalizante a fuertes concentraciones. Se aíslan los descendientes salidos de VL3c y P3 con la ayuda de un micromanipulador, después se someten a un test de sus propiedades fermentativas. Se cruzan los mejores clones en el laboratorio para reunir en el seno de una misma célula las ventajas de cada parental, sin tener los inconvenientes. Los resultados obtenidos en ensayos en bodega muestran cuan interesante es la levadura híbrida «14a» que produce poca acidez volátil y libera una importante cantidad de 4-MMP (4-mercapto-4-metilpentano-2-ona) con aroma de boj, capullo de grosella. En cuanto a la cepa Vl3c libera grandes contenidos de 3-MH (3-mer-captohexano-1-ol) que evoca el pomelo. La técnica del breeding lleva a la obtendón de cepas «híbridas», estériles en el caso de cruzamiento de cepas de especies diferentes (por ejemplo S. cerevisiae y S. uvarum). Mediante la técnia del cruzamiento, también se han obtenido cepas de levaduras, que producen elevados niveles de glicerol y que, cuando floculan, producen poco H2S. Este método de mejoramiento de las tevaduras no conlleva modificación genética; no se trata de Organismos Genéticamente Modificados(0GM). Por otra parte, los híbridos naturales S. cerevisiae - S. uvarum fuerón aislados e identificados a partir de microfloras indígenas de mostos en fermentación.

La otra estrategia de mejora de las levadas enológicas consiste en introdudr un carácter nuevo o en modificar un carácter existente, por clonación molecular. Los OGM son orgams cuyo patrimonio genético ha sido por procedimientos distintos de la multiplicación o la recombinadón natural. Previamente, es conveniente conocer bien el determinismo genético y la vía metabólica del carácter a modificar.

Los genes clonados en S. cerevisiaa salen de diferentes microorganismos, lo que permite liberarse de la barrera de especie y ampliar la fuente de genes transferibles. A titulo de ejemplo, la levadura capaz de realizar la fermentación maloláctica expresa a la vez el gen mleS codificando para la enzima maloláctica de Lactococcus lactis y el gen mae1 de Schizosaccharomyces pombe codificando para el transportador del malato. En condiciones enológicas, esta levadura es capaz de degradar 3 g/L de ácido málico en ácido láctico en 4 días, simultáneamente a la fermentación alcohólica. Numerosas aplicaciones provienen de la clonación molecular: la obtención de levaduras superproductivas de glicerol, secretando pectinasas, de cepas que no producen ureas, etc. No obstante, ninguna cepa OGM ha obtenido hasta ahora autorización para ser comercializada.

¿Cuáles son las posturas futuras en la selección de las levaduras enológicas? La enorme biodiversidad de las levaduras enológicas constituye un recurso genético innegable que debe ser, en un futuro, aprovechado para la selección de nuevas cepas. Los genomas de S. cerevisiae (1996) y S. uvarum (2003) han sido secuenciados y, a través de los bancos de datos informáticos, se puede acceder a ellos. Este conocimiento abre perspectivas de desarrollo en materia de selección de levaduras a dos niveles:

- Comprender mejor las vías metabólicas de la levadura en condición fermentativa y conocer los genes de interés en enología (crecimiento, tolerancia al etanol, liberación de aromas...).

- A partir de estos genes, desarrollar marcadores moleculares de selección utilizables para probar un gran número de cepas y para orientar los cruzamientos, evitando la etapa de microvinificaciones, que es extremadamente pesada.

Por otro lado, de todos es conocido el rol de la cepa en la producción de aromas fermentativos. Un hecho más reciente se refiere a la posibilidad variable, según la cepa, de revelar una fracción no volátil del aroma de la uva. Asi, sin olvidar que la calidad de las uvas constituye lo esencial de la calidad de los vinos, se aprecia que las cepas de levadura participan también en la expresión de su tipicidad. Por tanto, la mejora de nuestros conocimientos sobre los aromas y precursores de aromas varietales de un lado, y sobre los mecanismos de revelación de otro, permitirá seleccionar cepas susceptibles de revelar los distintos matices que varían de un terruño a otro.

Una vez elegida por estas propiedades tecnológicas, hay que probar la cepa de levadura según un último criterio ineludible para su desarrollo industrial: se trata de su aptitud a la producción industrial y al secado. Esta etapa final de la selección de las levaduras está controlada por el industrial que garantiza la producción de la cepa.

En caso de éxito, se obtiene una pequeña producción de algunos kilogramos de LSA. El seleccionador, en colaboración con los expertos, dispone de esta muestra para las experimentaciones en bodega a gran volumen. Sólo se tomará la decisión de desarrollo y de comercialización, una vez acabadas estas últimas pruebas.

Fuente: Vigne & Vin. Publications Internationales  

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