sábado, 2 de febrero de 2013

Levaduras Malolácticas



LEVADURAS MALOLÁCTICAS

- Justificación y utilización: Tras la fermentación alcohólica y el encubado, en el momento del descube para los vinos tintos, el vino alberga una población de bacterias lácticas compuesta sobretodo de 0. oeni a la concentración de 10 3 - 10 4 UFC/mL Si el vino es ácido y su grado alcohólico elevado, esta población es bastante menor, sólo del orden de algunas UFC/mL. Por el contrario, si el pH es elevado, las bacterias se han multiplicado durante los últimos dias de la FA o durante el encubado post-fermentativo. En este caso, la fermentación maloláctica arranca rápidamente.

Pero la mayoría de las veces algunos dias, o a lo sumo una a dos semanas, seperane el descube del principio de la fermentación maloláctica. Es el tiempo que precisa la población para alcanzar las 10 6 UFC/mL. Durante este tiempo, el vinificador ha de tomar una sola precaución, mantener la temperatura alrededor de 20 °C. Si a pesar de esto después de 3 semanas (o menos según las condiciones) el proceso no se ha iniciado, se recomienda la adición de una levadura maloláctica. El objetivo es compensar la microflora indígena deficiente. Se añaden las bacterias en masa de manera que la población umbral de 106 UFC/mL sea superada. La fase de multiplicación, que no ha tenido lugar para las bacterias indígenas, ya no es necesaria.

La degradación del ácido málico es la muestra más visible, y la más esperada, de la actividad de las bacterias. Está catalizada por la enzima maloláctica que, en el interior de la bacteria, descarboxila el ácido málico en ácido L-láctico. Para degradar todo el ácido málico del vino en un tiempo razonable, es necesaria cierta cantidad de enzima, que aporta la biomasa. Cuando añadimos una levadura maloláctica, todo ocurre como si añadiésemos al vino un preparado enzimático un poco especial. La enzima sólo funciona en condiciones muy controladas, que no se dan en el vino, sino únicamente en el interior de la célula bacteriana viva. La adición de levaduras malolácticas equivale pues, en primer lugar, a la de enzima maloláctica. Pero bacterias vivas en el vino, incluso si no son verdaderamente capaces de multiplicarse, no limitan su actividad a la descarboxilación del ácido málico. Utilizan numerosos otros componentes del vino, que transforman para obtener de ellos energía, y para intentar que, así, el entorno sea menos hostil. Las levaduras añadidas en masa y brutalmente en el vino emplean cualquier medio para intentar sobrevivir. La reacción maloláctica forma parte de esto, así como la degradación de azúcares, como las pentosas, la del ácido cítrico, los aminoácidos y muchas otras moléculas. Pero si la célula ya no puede adaptarse a la toxicidad del medio, porque ya no tiene energía, muere. En estas condiciones, desaparece la actividad maloláctica.

La adición de las levaduras malolácticas, destinada a sustituir la microflora indígena, requiere pues precauciones por parte del vinificador. No es tan sencilla como la adición de levaduras de una cuba de mosto, ya que a diferencia de las levaduras, las bacterias se añaden en un medio particularmente hostil. En general, la decisión de recurrir a la levadura maloláctica se toma en caso de falta de fermentación maloláctica espontánea. Pero, también, algunos elaboradores eligen inocular el vino sin esperar, tras el descube. En este caso, si la microflora indígena no ha alcanzado ya el límite de 10 6 UFC/mL, la levadura ocupa el medio. Garantiza la fermentación maloláctica y las otras transformaciones de las cuales la cepa es capaz. Se recomienda especialmente, lo antes posible, la sustitución de la microflora indígena si por experiencia se sabe que la bodega aloja una población indeseable de bacterias. Este es el caso de las bodegas donde las vinificaciones anteriores han mostrado la existencia de bacterias productoras de aminas biógenas.

Cada vez más ensayos describen también la inoculación de las levaduras al principio o durante la fermentación alcohólica. El argumento es la adquisición por la levadura de la tolerancia al medio y, consecuentemente, una supervivencia prolongada para asegurar la fermentación maloláctica. Sin duda, éste está fundamentado. Sin embargo, no es fácil controlar la competición entre levaduras y bacterias lácticas. Si ésta acaba en una dominancia demasiado fuerte y precoz de las bacterias, lleva al picado láctico. Sólo en el caso de los mostos ácidos, el equilibrio entre las dos microfloras puede mantenerse correcto. Pero es difícil apreciar el nivel de acidez que garantiza este equilibrio, ya que depende de otros parámetros que dirigen el crecimiento de las bacterias. Para mayor seguridad, y siendo tan complicado el control de esta competición, no se recomienda añadir una levadura maloláctica antes del final de la fermentación de los azúcares por la levadura. En la mayoría de los casos, se recomienda inoculación en el descube, o algunos días después.

Al principio de los ochenta, ante las dificultades halladas para inocular los vinos con 0. oeni, un productor de levadura (Ch. Hansen) propuso inocular los mostos con una cepa de Lactobadllus plantarum (Viniflora LP). En este caso muy particular, la bacteria, cuya actividad maloláctica es muy fuerte, degrada el ácido málico a partir de su incorporación al mosto. No se multiplica y su viabilidad se va reduciendo poco a poco debido a la inhibición ejercida por Saccharomyces cerevisiae. Pero mientras su población viable sea suficiente, la fermentación maloláctica sigue. No obstante, tras algunos días de fermentación alcohólica, la levadura ha desaparecido. En función de la velocidad con la cual la levadura invade el medio, queda más o menos ácido málico no degradado. Su utilización es delicada, pero adecuada para la desacidificación parcial de los vinos blancos. Su intervención es prácticamente limita a la descarboxilación del ácido málico. No influye en los caracteres sensoriales del vino.

- Selección y fabricación de las levaduras: Las levaduras malolácticas más comunes son todas cultivos puros de Oenococcus oeni con excepción de Viniflora LP. Han existido levaduras mixtas incluyendo varias cepas, pero no han demostrado una mayor eficacia. En estas mezclas, no es exacto decir que las cepas van a suceder unas tras las otras. La mayoría de las veces, una cepa se impone, eliminando las demás.

Las cepas destinadas a la preparación de levaduras, se aíslan de vinos en curso de fermentación maloláctica. Generalmente, se eligen los vinos más ácidos y alcoholizados, en los cuales la fermentación maloláctica se ha hecho espontáneamente. Los aislamientos pasan forzosamente por el cultivo sobre medio nutritivo de agarosa. La única forma es aislando colonias. Luego, hay que purificarlas mediante repicados sucesivos en medio sólido, ya que contrariamente a la teoría, muy pocas veces una colonia contiene una sola cepa. Tras el aislamiento, se identifican las cepas. Sólo hay que coger las cepas de 0. oeni, pero en los medios de agarosa todas las especies de bacterias lácticas presentes en el vino forman colonias. Desde ahora, la identificación siempre se realiza por hibridación de ADN o por PCR. A continuación, se evalúan las cepas por sus aptitudes enológicas, es decir, ante todo, por su capacidad de tolerar un pH ácido y una concentración en etanol elevada y, por supuesto, de degradar el ácido málico. El criterio de tolerancia al frío no es prioritario. En cuanto a la resistencia al SO2, si existe, es de todos modos discutible. Primero porque en el momento en el que necesita la aportación de una levadura, el vino no contiene SO2 libre en cantidad, excepto en caso de sulfitado inapropiado. Luego, porque si se aislara realmente una cepa resistente al SO2, los problemas de estabilización no tardarían en aparecer. Las dificultades de estabilización microbiológica de los vinos son bien conocidas.

Por ahora, los únicos criterios que intervienen en la selección son la supervivencia y la adaptación al medio. Incluso si la práctica muestra que, desde el punto de organoléptico, todas las cepas no dan el mismo resultado, no existe ninguna base importante para hacer intervenir el criterio sensorial en la selección. En cambio, se pueden tomar en cuenta otros criterios hasta aquí considerados como secundarios. Por ejemplo, nos aseguramos de que las cepas candidatas no produzcan amina biógena (histamina, tiramina), o no posean un profago fácilmente inducible, que perturbaría la fabricación industrial de la levadura.

Después del aislamiento y la purificación, la producción de las levaduras hace intervenir las clásicas etapas de multiplicación, cosecha de la biomasa y preparación para la comercialización. La multiplicación se realiza por siembra de volúmenes de medios de cultivo cada vez mayores. Se estudian los medios y las condiciones de cultivo para obtener el mejor rendimiento de biomasa, teniendo en cuenta el coste de la preparación. Las células son separadas del medio y concentradas por centrifugación, y luego preparadas para la liofilización. En esta etapa, se deshidratan las bacterias al vacío tras congelación. Es el modo más eficaz de preservar la viabilidad por varios meses. El producto se envasa en paquetes que contienen las cantidades de bacterias necesarias para inocular volúmenes de vinos que van desde la barrica hasta los 250 hl según los fabricantes.

- Las preparaciones comerciales y su utilización: A principios de la década de los 80, se comercializaron las primeras levaduras malolácticas eficaces. Las pioneras se encontraban bajo forma congelada, aunque rápidamente aparecieron las preparaciones liofilizadas, lo que evidentemente ha facilitado la comercialización. En cualquier caso, estas levaduras, denominadas a veces de «primera generación», necesitaban una fase de reactivación antes de su utilización, que no se debe confundir con la práctica de los pies de cuba. La reactivación en un medio formado por zumo de uva diluido al 5O % con agua (o de vino diluido) y extracto de levadura añadido, consiste en incubar las bacterias durante 24 horas (como máximo 48 h) a una temperatura de 20 a 25 °C. Su objetivo es readaptar, a las condiciones del vino, las células de O. oeni que, durante la preparación industrial, han perdido su adaptación natural. Durante esta fase, que no permite la multiplicación, las células se modifican, en particular a nivel de su membrana, de manera que toleran mejor la agresividad del medio y sobreviven tras la inoculación.

Una vez definitivamente demostrados el interés y la necesidad de la reactivación, las levaduras malolácticas, que hasta entonces nunca habían sido satisfactorias, han empezado a interesar a los enólogos. Sin embargo, aunque la manipulación sea sencilla, incluso si el paquete de bacterias venía acompañado de un paquete de «reactivador» a disolver en el zumo de uva o el vino diluido, el protocolo seguía siendo bastante delicado y pesado. En período de vinificación, la atención requerida por esta operación no siempre era bien aceptada. Además, una levadura reactivada según este protocolo debe utilizarse en los plazos previstos, no siendo admisible por ejemplo retrasar el descube de una cuba. Con el tiempo, el modo de utilización ha ido evolucionando poco a poco. En muchos casos, este protocolo de reactivación viene seguido de la confección de pies de cuba sucesivos empleando volúmenes crecientes de vino. La preparación del pie de cuba final puede llevar más de una semana.

En 1993, Ch. Hansen preparó y comercializó la primera levadura de 0. oeni para la siembra directa de los vinos (Viniflora Genos). La cepa fe 0. oeni, tras ser aislada, fue multiplicada en medio industrial habiendo sufrido antes de su preparación para el acondicionamiento, una etapa de pre-adaptación. Posteriormente, el mercado ha ofrecido otras fabricaciones. Después de la liofilización, las biomasas así obtenidas son directamente añadidas, o simplemente puestas en suspensión en el agua antes de la incorporación al vino, según las recomendaciones del fabricante. La pre-adaptación garantiza una supervivencia suficiente y la biomasa añadida activa la degradación del ácido málico tras algunos días.

Cualquiera que sea el tipo de levadura, su concentración en bacterias debe ser suficiente para llevar a 5 x 10 6 UFC/mL, al menos, la población en el vino inoculado. Pero el éxito de la siembra por las levaduras malolácticas pasa también por el cumplimiento de reglas enológicas sencillas. La temperatura del vino en el momento de la inoculación debe ser cercana a los 20 ºC y la concentración en SO2 libre debe ser nula. La falta de cumplimiento de estas dos condiciones evidentes explica la mayor parte de los fracasos. No obstante, quedan dificultades que no se pueden explicar sólo considerando los 4 factores determinantes: temperatura, SO2, grado alcohólico y pH del vino. En estos casos, con frecuencia el tratamiento previo del vino con 20 g/hL de envueltas celulares de levaduras (cortezas de levaduras) mejora mucho la eficacia de la levadura. Antes de la inoculación, el vino es trasegado para eliminar la mayor parte de las cortezas. Por último, para los vinos difíciles, se aconseja la práctica de los pies de cuba, incluso utilizando levaduras previstas para la inoculación directa.

Existe en el mercado una quincena de preparaciones de levaduras para la inoculación directa o no que, según su perfil en campo pulsado, provienen de una decena de cepas. Se propone una cepa bajo las dos formas: a reactivar y preadaptada, MicroenosBl (distribuida por Laffort Oenologie). No es posible, todavía, elegir la levadura maloláctica en función del tipo de vino deseado, de su incidencia sobre los aromas o incluso sobre el color de los vinos. Estas perspectivas son aun lejanas debido a la falta de conocimientos sobre las transformaciones realizadas por las bacterias. La cuestión es compleja ya que la práctica muestra que las cepas pueden dar resultados diferentes según los vinos. Actualmente, primero hay que asegurar la supervivencia de las bacterias y su actividad maloláctica. El problema más complicado es el de los vinos blancos de pH ácido. Las observaciones indicadas a lo largo de las experimentaciones o por los propios vinificadores no son suficientemente coherentes para aconsejar tal o tal levadura en función de las condiciones.

- Control de implantación: Las cepas de 0. oeni están bien identificadas y caracterizadas por su perfil genético. La hidrólisis de su ADN, seguido de la separación en electroforesis en campo pulsado de los fragmentos de ADN producidos, es el único método que, hasta ahora, puede permitir certificar la identidad de la cepa. Los seleccionadores y los productores lo utilizan para garantizar el control de calidad de su preparación. El mismo método permite al vinificador asegurarse de la implantación de la levadura.

La biomasa de bacterias recogida en el vino durante la fermentación maloláctica es analizada como si se tratase de una cepa pura. El perfil de ADN se compara con el de la cepa inoculada como levadura maloláctica. Según los casos, sólo se encuentra este perfil, acabando en la implantación de la levadura. Algunas veces este perfil es reconocible, superpuestos a un perfil más complejo, lo que significa que la levadura ha participado a la fermentación maloláctica con el mismo título que la microflora indígena. Por último, si el perfil de la levadura no aparece, se considera que la microflora indígena es el actor principal del proceso.

Fuente: Vigne & Vin. (Publications Internationales) 

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