martes, 24 de septiembre de 2013

¿Qué hay detrás de las pectinasas para la enología? Interés de la purificación de las enzimas


¿QUÉ HAY DETRÁS DE LAS PECTINASAS PARA LA ENOLOGÍA? INTERÉS DE LA PURIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS

Dr. Rose-MarieCanal-Llaubères
Gerente RCL-BIOPROCES (Burdeos, Francia)
www.rcl-bioprocess.com

Introducción

Hoy los consumidores de vino están siempre más atentos a la fineza aromática. Ciertos olores caracterizados, algunas veces asimilados al terruño, no son aceptados en el mercado internacional del vino. A un cierto nivel de concentración los fenoles volátiles son responsables de desvíos olfativos. Por debajo del umbral de percepción, estos compuestos ocultan los aromas afrutados de los vinos blancos, rosados y tintos. Los vinos parecen pesados, han perdido su frescura. La formación de los fenoles volátiles es un proceso enzimático con varías etapas. Las enzimas de la levadura y de los hongos juegan un papel en la producción de los vinil y etil fenoles.
Este articulo se propone, por un lado, presentar una síntesis de los trabajos de investigación que han permitido descubrir los mecanismos implicados en la liberación de estos compuestos. Por otro, quiere dar referencias sobre las razones de la purificación de las pectinasas para la enología -pectinasas FCE o "Free of Cinnamoyl Esterase" -, herramientas siempre más usadas para mejorar los procesos de elaboración de los vinos.

Origen de la formación de los fenoles volátiles

Los precursores son los ácidos hidroxicinámicos presente en la uva y son el origen de la formación de los fenoles volátiles. Existen también ligados al ácido tartárico como esteres tartáricos de ácidos hidroxicinámicos. Los esteres son hidrolizados por los hongos Botrytis cinerea o por las preparaciones de pectinasas comerciales producidas por cultivos seleccionados de Aspergillus niger, y así aumentan el pool de precursores o ácidos hidroxicinámicos libres (Chatonnet et al., 1992; Dugelay et al., 1993).

Localizados en las vacuolas de las células del hollejo y, en menor medida, en las de la pulpa, son principalmente los ácidos cumárico y ferúlico, los compuestos que concurren a la formación del vinil-4-fenol y del vinil-4-guayacol. La concentración depende del tipo de uvas y de las condiciones de maduración de la fruta. En zonas cálidas la uva produce más ácidos hidroxicinámicos. También las uvas las más aromáticas contienen concentraciones mayores en precursores. Estos compuestos son transformados en fenoles por las levaduras presente en la uva o las levaduras secas activas (Saccharomyces cerevisiae) y por la levaduras de género Brettanomyces durante la crianza. Brettanomyces libera los etil fenoles correspondientes, el etil-4-fenol y el etil-4-guaicol.

Controlar el nivel de ácidos libres es una de la claves para limitar la formación de les fenoles. Eso se realiza usando preparados de pectinasas extra purificadas durante las fases de maceración de la uva y de clarificación del mosto para evitar la hidrólisis de los ácidos hidroxicinamoiltartáricos. Por supuesto, el control y la maestría de la microflora es otro parámetro muy importante para producir vinos con aromas distintos y finos. Las formas combinadas y libres coexisten en el mosto durante la vinificación.



Las vías enzimáticas de la formación de los vinil y etil fenoles

El aumento de la concentración en ácidos hidroxicinámicos proviene del uso de pectinasas para la extracción o la clarificación. La mayoría de las cepas de Aspergillus sp. -hongo común e inofensivomicroorganismo GRAS (“Generally Recognized As Safe”) que se usan para la producción de pectinasas producen esterasas (Barbe, 1995). De las tres esterasas identificadas por Barbe y Dubourdieu (1998) una sola es capaz de hidrolizar los ácidos hidroxicinamoiltartáricos: la Cinamoil Esterasa o CE(Figura 2). Esta enzima fue purificada de un preparado enzimático comercial de pectinasas. Su peso molecular es de 240,000 Dalton. La enzima tiene dos subunidades. Todos los preparados de pectinasas contienen esta actividad.

El nivel de CE depende de la cepa y del método de producción, puede variar de un factor 1 a 100. Es decir que algunas pectinasas pueden tener un nivel alto de Cinamoil Esterasa. Se necesita una etapa específica de purificación para eliminar esta actividad en las pectinasas. El papel negativo que juega esta enzima en la elaboración del vino fue identificado por la primera vez por Burkhardt (1976) en vinos blancos alemanes. El autor notaba una pérdida de aromas frutados y la aparición de notas pesadas enmascarando la tipicidad de los vinos. Descubrió que la razón fue el uso de pectinasas en clarificación y apreció esta actividad enzimática depsidasa. Mucho más tarde, los trabajos de investigación de Chatonnet et al. (1992) y Dugelay et al. ( 1993) permitieron identificar los mecanismos de hidrólisis y designar correctamente la actividad enzimática responsable del aumento de los ácidos hidroxicinámicos, la Cinamoil Esterasa.

¿Por qué las levaduras producen fenoles volátiles?

La mayoría de las cepas de levaduras, que sean autóctonas o exógenas (levaduras secas activas), Saccharomyces y también las levaduras del genero Brettanomyces, posean una actividad enzimática Cinamato Descarboxilasa ó CD. Estas levaduras son caracterizadas como “pof+” (phenolic off flavour) es decir que tienen el gen que codifica la proteína enzimática responsable de la formación de los fenoles volátiles. Así, estas levaduras pueden convertir los ácidos p- cumárico y ferúlico en vinil-4-fenol y vinil-4-guayacol respectivamente (Figura 2). Esta temática es muy bien conocida por los productores de cerveza que han seleccionado levaduras “pof-“ que no sintetizan la enzima CD. En enología existen también algunas cepas de levaduras “pof- “ seleccionadas para que no produzcan la
actividad CD. Estos vinil fenoles se encuentran en los vinos blancos y rosados. Aun teniendo un alto umbral de percepción (ca. 700 μg/l), confieren al vino olores de farmacia o de solvente -el vinil-4-fenol siendo mayoritario- en detrimento con las propiedades organolépticas. Se disminuye la sensación de afrutado y de frescura aromática. Solo el uso de pectinasas extra purificadas permite
de controlar al nivel de fenoles volátiles en el vino (Figura 3).


El uso de una pectinasa extra purificada (Vinozym® FCE*) permite de limitar la formación des vinil-4-fenol. El vino producido con una pectinasa conteniendo la actividad CE tiene 60% más de vinilfenoles y fue rechazado por el panel de degustación. Resultados similares fueron obtenido por Barbe(1995) con varias uvas (Sémillon, Muscat, Riesling). * Free of Cinnamoyl Esterase En los vinos tintos, los vinil fenoles son reducidos por la actividad vinil fenol reductasa, VFR de Brettanomyces (Figura 2) o de algunas bacterias lácticas del género Lactobacillus en etil-4-fenol y etil-4-guayacol aportando al vino olores animales o de cuero (Chatonnet et al., 1995; Couto et al., 2006). El carácter “Brett” es siempre más reconocible por los compradores y consumidores de vinos. Entonces el uso de pectinasas extra purificadas tiene que ensancharse a la producción de vinos tintos. Así las investigaciones de Gerbaux et al. (2002) muestran que el uso de pectinasas estándar, no purificadas de la actividad CE, es responsable de un aumento de tres veces de la concentración en
etilo fenoles en vinos sembrados con Brettanomyces. Al contrario, el uso de pectinasas extra purificadas FCE no aumenta estos compuestos volátiles.

Por otro lado, otros investigaciones han demostrado que los 4-vinil fenoles pueden influir en el color de los vinos tintos puesto que son capaces de reaccionar con los antocianinas y originar compuestos estables que aportan tonalidades naranjas a los vinos (Rentzsch et al., 2007, Ducasse, 2009). Otra buena razón para utilizar pectinasas FCE en tintos.

Control de la actividad cinamoil esterasa en las pectinasas para la enologia

Para evitar el aumento de los fenoles volátiles en los vinos es importante asegurarse que el nivel de los precursores utilizables por la levadura no va a cambiar durante las etapas per fermentativas. La solución es el uso de pectinasas extra purificadas FCE, sin actividad Cinamoil Esterasa, en extracción -maceración o prensado directo- y en clarificación. Desde del año 2002, las primeras pectinasas granuladas fueron comercializadas por la empresa Novozymes siguiendo la tesis de Barbe (1995) para la elaboración de los vinos blancos y rosados. Así nació el concept FCE (“Free of Cinnamoyl Esterase”). Se necesitó esperar hasta el año 2002 para ver el desarrollo de pectinasas extra purificadas FCE para los vinos tintos.

En el proceso de producción de las pectinasas con Aspergillus sp., los productores deben realizar una etapa suplementaria después de recoger el medio conteniendo las enzimas para eliminar la actividad CE. Existen dos métodos para purificar: una etapa de ultrafiltración o un tratamiento a pH ácido durante muchas horas. Esta etapa tiene una influencia sobre la pérdida de actividad pectinasa cuyo nivel deber ser compensado durante la estandarización del preparado enzimático. Para medir la actividad, la industria necesita un método para garantizar el nivel en su control de calidad. Así, la empresa Novozymes ha definido un nivel de CE (CINU: cinnamoyl esterase unit) relacionado a la actividad poligalacturonasa (PGNU: polygalacturonase unit) en sus preparaciones de pectinasas
( 0.5 CINU/1000 PGNU). La actividad CE se mide con la hidrólisis del ácido clorogénico o del cinamato de etilo como lo recomienda el OIV en el Código Enológico Internacional (oeno 6/2007) modificado durante la última reunión en Budapest (OIV-OENO 487-2013). Se debe notar que esta etapa de purificación tiene un efecto positivo sobe la reducción de la actividad beta-glucosidasa (“antocianasa”) también presente a niveles variables en los preparados de pectinasas.

Conclusión

Las pectinasas son siempre más utilizadas para optimizar los procesos de extracción y de clarificación de los mostos. El interés de la purificación para eliminar la actividad CE es incontestable. El enólogo o el productor de vino tienen que asegurarse de que los productos enológicos que usan en la elaboración de sus vinos no van a modificar de manera negativa los aromas. Gracias al uso de pectinasas certificadas FCE, no van a cambiar la composición inicial de sus mostos y no van a aumentar el pool de los precursores responsables de la formación de los fenoles volátiles. Para su tranquilidad, las nuevas normas europeas de etiquetado FIAP (Food Improvements Agents Package) facilita la trazabilidad de las enzimas. Hoy día es posible tener pectinasas de calidad enológica extra purificadas, diferentes de otras pectinasas para la industria agroalimentaria, con el fin de mantener una calidad aromática de alto nivel.

Agradecimiento. El autor agradece a la REVUE DES OENOLOGUES por su amable autorización de la publicación del artículo que apareció en su versión original en el N°148 de Julio 2013 (www.oeno.tm.fr).

Referencias bibliográficas

Barbe C., 1995. Recherches sur les activités estérases contaminantes des préparations pectolytiques. Applications technologiques. Thèse de Doctorat de l’Université de Bordeaux II.

Barbe C. and Dubourdieu D., 1998. Characterization and purification of a cinnamate esterase from Aspergillus niger industrial pectinase preparation. J. Sci. Food Agri., 78, 471-478.

Chatonnet P., Dubourdieu D., Boidron J.P., 1995. The influence of Brettanomyces :Dekkera sp. Yeasts and lactic bacteria on the ethylphenol content of red wines. Am. J. Enol. Vitic., 46, 463-468.

Chatonnet P., Barbe C., Canal-Llaubères R.-M., Dubourdieu D. and Boidron J.-N., 1992. Incidence de certaines préparations pectolytiques sur la teneur en phenols volatils des vins blancs. J. Int. Sci. Vigne Vin, 26, 253-269.

Couto J.A., Camos F.M. Figuereido A.R., Hogg A.H., 2006. Ability of acid lactic bacteria to produce volatile phenols. Am. J. Enol. Vitic., 57, 166-171.

Ducasse M.A., 2009. Impact des enzymes de macération sur la composition en polysaccharides et en polyphénols des vins rouges. Etude de l’évolution de ces composés en solution modèle vin. Thèse de Doctorat de l’Université de Montpellier II.

Dugelay I., Günata Z., Sapis J.-C., Baumes R. and Bayonove C., 1993. Role of cinnamoyl esterase activities from enzyme preparations on the formation of volatile phenols during winemaking. J. Agric., Food Chem., 41, 2092-2096.

Gerbaux V., Vincent B. and Bertrand A., 2002. Influence of maceration temperature and enzymes on the content of volatile phenols in Pinot noir wines. Am. J. Enol. Vitic., 53, 2, 131-137.

RentzschM., Schwarz M., Winterhalter P., Hermosin-Gutiérrez I., 2007. Formation of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Grenache wines: precursor levels and evolution during aging. J. Agric. Food Chem., 55, 4883-4888.

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