lunes, 16 de diciembre de 2013

Brettanomyces bruxellensis en el vino - Técnica qPCR



BRETTANOMYCES BRUXELLENSIS EN EL VINO

La Brettanomices bruxellensis es una levadura responsable de la presencia de 4-etil fenol, 4-etil guayacol y ácido isovalérico, entre otras sustancias en vino. Esta alteración que supone pérdidas económicas importantes y que puede afectar al vino a lo largo de todo el proceso de elaboración es cada vez más frecuente.

Aunque no están claras las vías por las que esta levadura puede entrar en una bodega (maquinaria, uvas, etc) lo que si está claro es que puede sobrevivir en barricas de roble durante años, infiltradas en la madera, de forma que la descontaminación es una difícil tarea.

La detección rápida, específica y precoz de esta levadura, durante el proceso de elaboración, ha de permitir al enólogo y al productor tomar medidas de prevención y eliminarla antes de la aparición del carácter fenolado característico de la alteración provocada por esta levadura.

Si bien esta levadura puede detectarse mediante microbiología clásica y métodos no específicos, las nuevas técnicas de Biología Molecular (PCR en tiempo real,qPCR) ofrecen soluciones de detección con elevados niveles de rapidez, sensibilidad y especificidad. Así,es posible determinar el riesgo en el que se encuentra el vino, y como evolucina aquel con el tiempo.

Ventajas de la Técnica qPCR

- Resultados en 6 horas, frente a los 12 días de las técnicas tradicionales.
- Método rápido, específico y sensible.
- Cuantitativo.
- Permite la adopción de medidas correctivas con anticipación.

PCR en tiempo real

La PCR cuantitativa (en inglés, quantitative polymerase chain reaction; qPCR o Q-PCR) o PCR en tiempo real (en inglés real time PCR; RT-qPCR o RT-Q-PCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que también se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea). En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa o en tiempo real, o RT-Q-PCR. Debe evitarse la confusión con la técnica denominada «PCR tras transcripción inversa» (RT-PCR, del inglés reverse transcriptase PCR), en la cual existe un paso de retrotranscripción de ARN a ADN pero que no necesariamente cuantifica el producto a tiempo real.

La PCR cuantitativa junto a los chip de ADN son modernas metodologías para el estudio de la expresión génica, aunque otros métodos tradicionales como el Northern blot, si bien, no con tanta precisión, también permiten su abordaje. La variabilidad que se introduce en la cuantificación y que conlleva a un error en la estima deriva de la integridad de ADN, eficiencia enzimática y otros muchos factores, por lo que se han desarrollado numerosos sistemas de estandarización. Los hay para cuantificar de forma absoluta la expresión génica, pero, de forma más común, se orientan a la cuantificación relativa del gen de estudio respecto de otro, denominado "normalizador", que se selecciona debido a su expresión casi constante; estos genes suelen denominarse, en inglés, house-keeping genes debido a que suelen estar involucrados en funciones básicas en la supervivencia celular, lo cual suele implicar una expresión constitutiva. De este modo, efectuando en cada experimento la medición de los genes de interés y dividiéndolos por la expresión del gen normalizador seleccionado es posible comparar los primeros aún sin conocer en términos absolutos su nivel de expresión. Los genes normalizadores más empleados son aquellos que codifican para las siguientes proteínas: tubulina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina, RNA ribosomales, etc.

- Fundamento: La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de el ADN polimerasa.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten en 25 - 40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mínimo de tres etapas: la primero, en torno a los 95 °C, permite la separación de los ácidos nucleicos de doble cadena; el segundo, a una temperatura en torno a los 50-60 °C, permite el alineamiento de los cebadores al ADN molde; el tercero, a 68 - 72 °C, facilita la polimerización por parte de la ADN polimerasa. Debido al pequeño tamaño de los fragmentos amplificados usualmente en este tipo de PCR puede omitirse el último paso, pues la enzima es capaz de amplificar durante la rampa entre la temperatura de alineamiento y la de desnaturalización. Además, algunos termocicladores añaden a cada ciclo unos segundos a otra temperatura, por ejemplo 80 °C, a fin de reducir el ruido por la presencia de dímeros de cebadores cuando se emplea un colorante inespecífico. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros, como: la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos (dNTPs) en la reacción y la temperatura de unión de los cebadores.

- Clasificación: Podemos clasificar las técnicas de PCR cuantitativa según el empleo de fluorocromos no específicos o bien de sondas moleculares dependientes de la secuencia.

En las técnicas basadas en fluorocromos inespecíficos se detecta la generación exponencial de ADN de doble cadena empleando un fluorocromo que se une inespecíficamente a aquél. Un ejemplo de colorante que permite esta detección es el SYBR Green), que, excitado mediante luz azul (λmax = 488 nm) emite luz verde (λmax = 522 nm). Posee la ventaja de requerir sólo un par de cebadores para efectuar la amplificación, lo que abarata su coste; sin embargo, sólo es posible amplificar un producto en cada reacción.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan al menos un oligonucleótido marcado fluorescentemente. Típicamente esta sonda está unida a dos fluorocromos e hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); esto es, en el amplicón. De este modo, cuando la sonda está intacta, presentan una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando los dos fluorocromos están distantes debido a la degradación de la sonda mediante la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa, o bien debido a la separación física de los fluorocromos por un cambio en la conformación de la sonda. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

- Análisis de temperatura de fusión: La Q-PCR permite, empleando un fluorocromo de unión inespecífica a la doble hebra de ADN, generalmente SYBR Green, identificar fragmentos amplificados de DNA concretos a partir de la temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting temperature), que es específica para el fragmento amplificado que se está buscando; y cuyos resultados son obtenidos a partir de la observación de la curva de disociación de las muestras de DNA analizadas.

Ello permite, a diferencia de PCR convencional, prescindir del posterior empleo de técnicas de electroforesis para la visualización de los resultados de todas las muestras. Porque, pese a que la PCR cuantitativa es una técnica cinética, suele ser evaluada a punto final. Así esta técnica lleva a la obtención de resultados más rápidos, y/o en el menos gasto de reactivos empleados en las técnicas de electroforesis; si según el criterio del investigador, posteriormente es necesario correr en geles solo las muestras cuyo resultados previos en el PCR en tiempo real se pueden considerar dudosos y/o para ratificar resultados en muestras positivas.

- Cuantificación de la expresión génica: La cuantificación puede realizarse en términos absolutos o relativos. En el primer caso, la estrategia es relacionar la señal de amplificación obtenida con el contenido en ADN empleando una curva de calibrado; para este enfoque es vital que la PCR de la muestra y de los elementos de la recta de calibrado posean una misma eficiencia de amplificación. En el segundo caso, se expresa el cambio en los niveles de expresión de ARN mensajero (ARNm) interpretado como ADN complementario (ADNc, generado por retrotranscripción del ARNm); esta cuantificación relativa es más fácil de realizar, puesto que no requiere curva de calibrado, y se sustenta en la comparación entre el nivel de expresión del gen a estudiar versus un gen control (también llamado de referencia, interno o normalizador o, en inglés, housekeeping gene).

Por tanto, en la cuantificación relativa es irrelevante en qué unidades se expresa la cuantificación, y sus resultados son comparables entre múltiples experimentos de RT-Q-PCR. De hecho, el propósito de emplear uno o más genes de normalización es corregir la variación no específica, como las diferencias en la cantidad y calidad del ARN empleado, que pueden afectar a las eficiencias de retrotranscripción y de PCR. No obstante, el aspecto crucial es que la estabilidad del gen de referencia sea una realidad.

La selección de los genes internos se ha realizado clásicamente en Biología Molecular analizando la estabilidad de la expresión en estudios cualitativos o de baja sensibilidad, como el examen visual de geles de ARN, densitometría de Northern blots o PCR semicuantitativa (PCR mimic). En plena era de la genómica, es posible realizar una aproximación a gran escala empleando los chips de ADN para muchos organismos. No obstante, se ha descrito que la mayoría de los genes empleados como normalizadores en la cuantificación de la expresión de ARN mensajero varían según las condiciones experimentales.12 13 14 Por ello, es preciso realizar un estudio metodológico previo a emplear a fin de seleccionar, con ayuda de herramientas estadísticas, los más apropiados.

Se han desarrollado varios algoritmos estadísticos que detectan qué gen o genes son los más apropiados para la normalización de un conjunto de tejidos bajo unas condiciones dadas: algunos, como geNORM o BestKeeper, realizan, sobre una matriz de expresión de genes de referencia para diversos tejidos, comparaciones por pares y medias geométricas.

No hay comentarios:

Publicar un comentario