miércoles, 26 de noviembre de 2014

Observación Microscópica de Microorganismos en Mostos y Vinos



OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE DIVERSOS MICROORGANISMOS QUE PODEMOS ENCONTRAR EN MOSTOS Y VINOS

Los microorganismos son imprescindibles para la elaboración de vinos. También son responsables de muchas enfermedades y resultan de gran utilidad en la industria alimentaria, farmacéutica y en la ingeniería genética.

Mediante la observación microscópica se puede observar las  levaduras y cómo transforman el mosto de uva en vino. Existen levaduras salvajes, presentes en la pruina de la uva, y levaduras que están presentes en la propia bodega. También hay levaduras beneficiosas y levaduras perjudiciales.

Es de gran importancia saver seleccionar aquellas levaduras que posean las características necesarias  para obtener un vino apto organolépticamente, así como la utilización LSA (Levaduras Secas Activas). Para evitar y también resolver las paradas y ralentizaciones fermentativas.


MATERIAL

- Tubo o placa con los microorganismos a estudiar (principales géneros de levaduras presentes en el vino, bacterias lácticas y acéticas).
- Portas y cubreobjetos
- Agua estéril para frotis
- Asa de siembra
- Aceite de inmersión
- Pinzas de madera
- Microscopio
- Colorantes:

Tinción de GRAM
- Solución de cristal violeta (1 % en agua)
- Solución de I2/Kl (Lugol)
- Alcohol/acetona (1:1)
- Solución de Safranina (2% en etanol agua 1:9)


FUNDAMENTO

El estudio de los microorganismos y el estudio de sus caracteres para ser identificados se basa en tres tipos de técnicas: microscópicas, de cultivo y de experimentación biológica.

Las técnicas microscópicas tienen su fundamento en la aplicación del microscopio óptico, que permite constatar la presencia de microbios en un determinado ambiente, comprobar si hay diversidad, determinar sus respectivas morfologías, percibir si son móviles o inmóviles, observar su comportamiento en presencia de sustancias colorantes o determinar su tamaño y agrupaciones de sus células.

Los microorganismos podemos observarlos al microscopio de tres métodos diferentes:

1. OBSERVACIÓN EN FRESCO:

Consiste en visualizar el microorganismo en una suspensión microbiana.

2. TINCIÓN SIMPLE:

Para visualizar el microorganismo se fija con calor y posteriormente se tiñe con un colorante.


3. TINCIÓNES DIFERENCIALES. TINCIÓN DE GRAM

Es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en el laboratorio de microbiología. Las bacterias en función de determinadas características de su pared celular, van a tener una diferente capacidad de ser teñidas y decoloradas por diferentes compuestos. La tinción se realiza con cristal violeta, solución de yodo, el alcohol acetona es un decolorante y la safranina es una tinción de contraste.

- Las bacterias Gram + retiene el cristal violeta y no se decoloran, se visualizan de un color violeta oscuro.
- Las bacterias Gram - se decoloran con alcohol acetona y por el contraste con la safranina aparecen rojas.
- Las bacterias lácticas son cocos o bacilos, Gram +, se visualizan violetas
- Las bacterias acéticas son cocos, Gram - , se visualizan rojos. 


MÉTODO

Realiza una suspensión con el microorganismo a estudiar en un tubo con 3 ml de agua destilada estéril.

1°.- Observación en fresco: Poner una gota en un portaobjetos y cubrir con el cubreobjetos, con cuidado de que no queden burbujas. Observar al microscopio con el objetivo de x10 y x 40 (nunca por el de 100). Observar las formas microbianas, su tamaño y su forma.

2°.- Preparación y fijación de frotis para tinción: Poner una gota de agua en el portaobjetos. Coger con el asa 1-2 colonias y resuspender en la gota, dejar secar al aire y después fijar a la llama, pasando varias veces por el mechero sin que llegue a quemar. De esta forma tenemos la preparación lista para ser teñida.


- Tinción simple: Cubrimos la preparación previamente fijada a la llama con el colorante y la mantenemos durante 1 minuto. Lavamos al grifo y la dejamos secar al aire. La observamos al microscopio utilizando primero el objetivo de 10 x, y el de 40 x. Para utilizar el objetivo de 100 es necesario utilizar aceite de inmersión.

Esta tinción se utiliza para visualizar levaduras.

- Tinciones diferenciales:

Tinción de Gram: Partir del frotis del microorganismo preparado y fijado. Posteriormente realizar la tinción siguiendo los siguientes pasos:

1. Cubrir con cristal violeta y mantener durante 1 minuto
2. Lavar con agua de grifo
3. Cubrir con Lugol y mantener y durante 30 segundos
4. Lavar con agua
5. Decolorar con una mezcla de alcohol/acetona (1/1) hasta que no se libere más colorante.
6. Lavar con agua
7. Cubrir con safranina y mantener durante 1 minuto
8. Lavar con agua
9. Dejar secar al aire y observar con el objetivo de x100 con aceite de inmersión.

Tinción de esporas. 



MUESTRAS

- Bacterias lácticas Bacterias acéticas
- Levaduras (diferentes géneros de levaduras vínicas)
- Bacterias lácticas de yogur (Streptococcus Termophilus y Lactobacillus Bulgaris)
- Hongos filamentosos, Mohos

PRINCIPALES GÉNEROS DE LEVADURAS VÍNICAS

- Zygosacharomyces
- Pichia
- Rhodotorula
- Schizosacharomyces Pombe
- Candida vini
- Bretanomyces
- Sacaromyces cerevisiae
- kloeckera Apiculata


PARTES DEL MICROSCOPIO

Sistema óptico:
- Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
- Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
- Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
- Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
- Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecánico:
- Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
- Platina: Lugar donde se deposita la preparación.
- Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular,
- Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
- Tornillos de Enfoque: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.


MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
c. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.


5 - Empleo del objetivo de inmersión: (objetivo de 100)
a. - Bajar totalmente la platina
b. - Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
c. - Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.
d. - Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
e. - Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
f. - Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
g. - Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
h - Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
i.- Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
j.- Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

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