miércoles, 7 de enero de 2015

Utilización de LSA (Levaduras Secas Activas) en la Fermentación del Vino




UTILIZACIÓN DE LSA (LEVADURAS SECAS ACTIVAS) EN LA FERMENTACIÓN DEL VINO

La fermentación se puede llevar a cabo de forma: Espontánea o Inducida por inoculación (LSA).

De todas las levaduras que se pueden encontrar en una fermentación alcohólica (levaduras procedentes de la propia uva o del material típico de bodega), se ha visto que Saccharomyces Cerevisiae es la más idónea para consumir todos los azúcares fermentables y, por tanto, asegurar el proceso.

Estudios realizados sobre las fermentaciones espontáneas, muestran que la microbiota cambia cada vendimia. Mostrando diferencias, tanto cualitativas como cuantitativas, en las levaduras aisladas en una misma zona vitivinícola e, incluso, dentro de los depósitos de una misma bodega. Las causas de esta variabilidad pueden ser: cambios en las técnicas de vinificación, viticultura aplicada, diferencias en las vendimias, cambios en las condiciones climáticas, etc.

- Las fermentaciones alcohólicas realizadas espontáneamente: No se deben a la acción de una única especie, ni de una única cepa de levadura, sino que es el resultado de la acción combinada de diversas especies de levaduras, que crecen más o menos siguiendo una sucesión a lo largo de la fermentación, que se postula como la siguiente:

. Primero aparecen las levaduras de primera fase, como son las apiculatas, poco resistentes al alcohol y productoras de acidez volátil;
. A éstas, le suceden Saccharomyces Cerevisiae;
. Y al final, si hubiera mucho alcohol, se instalan Saccharomyces Bayanus.

O al menos eso es lo que justifican las casas comerciales y sus estudios. También se postula que de forma espontánea, los resultados no son predecibles  en algunos casos y dependerá de los diferentes factores del medio.

- En la actualidad, y, en la mayoría de los casos, se realizan las fermentaciones con las levaduras comerciales (LSA): Pero también es posible hacerlo, con cultivos puros de levaduras, que procedan de una determinada zona vitivinícola. A estas levaduras se las conoce como levaduras locales seleccionadas. 

Una bodega puede obtener una levadura seleccionada y conservarla para futuras fermentaciones, pero ello requiere mucha inversión en infraestructura y tener muchos conocimientos de Microbiología. Como solución más fácil, se opta por comprar LSA en las casas especializadas en productos enológicos.

Una fermentación inducida por inoculación (LSA), implica utilizar levaduras secas activas. De esta forma los resultados pueden ser muy predecibles, reproducibles y se llega a obtener un vino con unas características muy definidas.

Las LSA deberán cumplir ciertos requisitos:
- Llevar a cabo una fermentación vigorosa y completa hasta conseguir un vino seco (sin azúcar residual).
- Conseguir características reproducibles y predecibles en la fermentación.
- Tolerar el etanol.
- No producir gustos o aromas extraños.
- Tolerar el SO2.
- Flocular (facilita su retirada).

La cepa de interés (comercial o de selección propia) de LSA se reproduce bien en las siguientes condiciones:
- Condiciones aerobias.
- Medio rico, pero con baja concentración de glucosa < 0,2%

En estas condiciones, se favorece el metabolismo respiratorio y la formación de factores de supervivencia (alto número de mitocondrias, altos niveles de ácidos grasos insaturados y esteroles), necesarios para su reproducción tras la inoculación en el mosto.

La dosis recomendada que se añade al mosto es de 0.1-0.2 g/l de mosto (aproximadamente 106 células de levadura por ml).



SELECCIÓN DE LSA CARACTERES DESEABLES

Las técnicas de selección que se utilizan para la mejora de cepas enológicas:

- Selección clonal: Es la técnica más antigua y más difundida. Consiste en aislar levaduras de entre una gran población de cepas de levaduras autóctonas y analizar a nivel de laboratorio si poseen las características deseadas.

Algunas de esas características son: factor Killer, bajas productoras de acidez volátil, poder fermentativo alto, no espumogénicas, no productoras de sulfhídrico, resistentes al sulfuroso, resistentes al etanol, osmófilas, etc.

Seleccionadas las mejores, se obtienen cultivos puros que se ensayan a nivel industrial. Tras garantizar su estabilidad en el tiempo pueden ser comercializados como cultivos "starters".

- Transformación: Consiste en introducir, mediante las técnicas de ingeniería genética, ADN procedente de otro organismo en la cepa microbiana que deseamos convertir en un "starter". A este ADN se le denomina ADN recombinante. Si la cepa receptora expresa y mantiene el nuevo ADN, y éste le confiere la característica deseada, pasaríamos de los ensayos de laboratorio a la escala industrial y a su posterior comercialización. Habríamos conseguido organismos modificados genéticamente.

Caracteres Deseables:

- Curva de crecimiento. Fase de latencia corta: Que sea capaz de iniciar la fase exponencial de la curva de crecimiento en el menor tiempo posible o lo que es lo mismo, que tenga una fase de latencia corta y sea capaz de competir con la flora presente en el mosto-vino.

- Poder fermentativo: A una levadura vínica se le debe exigir un alto poder alcohológeno, ya que así se asegurará la finalización de los azúcares y, a la vez, que sea osmófila, es decir, que resista altas concentraciones de azúcares.

- Producción de metabolitos: Se trata de que la levadura produzca metabolitos aptos organolépticamente, como el glicerol, ésteres, alcoholes, y reduzca hasta la nulidad la producción de aquellos que no son aptos, como el ácido acético, sulfídrico , ect.

- Liberación de aromas: Consiste en seleccionar aquellas levaduras que poseen elevada actividad β-glucosidasa. Esta enzima hidroliza a los azúcares unidos a los terpenos por un enlace β-glucosídico liberando así, al verdadero compuesto aromático que es el terpeno libre. El terpeno ligado a un azúcar no tiene propiedades odoríferas.

- Caracter floculante: Es la propiedad que tienen algunas levaduras de aglomerarse al finalizar la fermentación alcohólica y formar grumos que sedimentan en el fondo del recipiente. De este modo, facilitan la clarificación espontánea del vino.

- Resistencia a otros factores adversos: Como por ejemplo: Sulfuroso, fitosanitarios, bajo pH, etc. La resistencia a estos factores le permite al "starter" enológico desarrollarse en un medio que, en principio, le es hostíl.

- Degradación del ácido málico: Que posea la capacidad de realizar la fermentación maloalcohólica. De esta manera, se produce la desacidificación biológica de los vinos. También se está intentando la transferencia de material genético de las bacterias malolácticas a Saccharomyces cerevisiae con el fin de lograr una cepa que realice la FA y FML a la vez ,aunque de momento no está permitido su uso en Europa.

- Capacidad de fermentar a temperaturas bajas: Son levaduras seleccionadas por su capacidad para llevar a cabo la fermentación alcohólica a temperaturas muy bajas (6-10ºC). Son criófilas. Su principal interés está en utilizarlas en los países de climas fríos.

- Factor "killer": Es la característica de algunas cepas capaces de producir una proteína "asesina" que destruye a otras cepas, permitiendo a la poseedora de este carácter dominar el cultivo. El factor "killer" es específico para cada cepa, de modo que una cepa A puede ser "killer" para una cepa B y ésta a su vez ser "killer" para otra cepa. Una vez establecidas cepas con factor "killer" en una bodega es difícil eliminarlas.

Las cepas  Killer producen la tóxina (K+) y su factor de inmunidad (R+): Teniendo en cuanta esto, en relación con el factor Killer, las levaduras pueden presentar los siguientes fenotipos:

. Sensibles: serán "asesinadas" por las levaduras Killer. Su fenotipo sera: (K-, R-)
. Neutras: no son Killer pero son inmunes a la toxina. Su fenotipo será: (K-, R+)

- Carácter filmógeno:
Se denomina también, carácter flor, y es la capacidad que poseen algunas levaduras para generar un velo en la superficie de los vinos de alta graduación alcohólica. Se desea en la elaboración de los vinos de Jerez.


CRITERIOS A SEGUIR EN LA SELECCIÓN DE LSA

Se establecen grupos de criterios en orden de importancia:

1. Se seleccionarán aquellas que: (Si cumplen este paquete de factores se aceptarán, si no serán rechazadas).
- No produzcan acidez volátil.
- No produzcan sulfhídrico.
- No sean espumogénicas. Resistan el sulfuroso.
- Sean osmófilas y alcohológenas.
- Tengan fase de latencia corta.
- Que sean floculantes.
- Factor Killer

2. Se buscarán más caracteres como:
- Tengan resistencia a temperaturas extremas.
- Produzcan buenos aromas.
- No sean exigentes con los nutrientes.
- Posean capacidad maloalcohólica.
- Posean actividad glicosidásica.
- Otros.

Según las zonas vitivinícolas estas características pueden variar. Por ejemplo, en Jerez, el carácter filmógeno estaría en el primer paquete. En una región fría, interesaría que fuera criógena. En regiones productoras de mostos ácidos la resistencia a la acidez será prioritaria. Y así, sucesivamente

3. Con aquellas levaduras que han pasado el primer control de poseer esos caracteres deseables; se realizará una siembra, en mosto estéril, con cada una de ellas, tras fermentarlo, se realizará una cata y se elegirán a aquellas levaduras que posean el mejor perfil aromático y gustativo.

Utilizamos mosto estéril, para asegurarnos realmente de que la cepa de levadura que ha realizado la fermentación es aquella que hemos inoculado. Si no es estéril.

4. Posteriormente, con estas cepas seleccionadas se realiza una microvinificación que simule a la vinificación industrial. Se necesaria realizar una microvinificación, porque tenemos que comprobar que lo demostrado a nivel de laboratorio se cumpla a nivel industrial. Es mucho el dinero y el tiempo invertido, y no podemos cometer errores. El producto, en este caso, nuestra levadura seleccionada, debe funcionar a nivel industrial.

5. Por último, si la cepa de levadura supera esta última fase, ya se considera seleccionada y apta para la vinificación.


SELECCIÓN Y PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

Las técnicas clásicas de identificación de microorganismos, basadas en pruebas bioquímicas, son lentas y, normalmente, sólo permiten llegar a determinar la especie, pero no las variedades o cepas de una misma especie microbiana. Actualmente, con las técnicas de ingeniería genética basadas en el análisis de ADN microbiano, diferenciarlas es posible, sabiendo que levadura estamos utilizando, la que hemos seleccionado, o la que hemos comprado, ya que dichas técnicas permiten diferenciar de forma rápida y segura, las distintas cepas de una misma especie.

- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
Consiste en extraer el ADN de los microorganismos, cortarlo en sitios concretos por medio de unas "tijeras", los llamados enzimas de restricción. Posteriormente se amplifican estos fragmentos con un termociclador. Los fragmentos amplificados se someten a la siguiente técnica para visualizarlos:

- Electroforesis de ADN en gel de agarosa:
Los fragmentos de ADN que se han amplificado se "pinchan"  en un gel de agarosa y se someten  a un campo eléctrico. Los fragmentos de ADN se desplazan en función de su tamaño y carga, dando patrones concretos para cepas concretas

CONSERVACIÓN

Una vez seleccionadas aquellas que tenían interés comercial, deben reproducirse para obtener las cantidades necesarias, es decir, una elevada biomasa y poder ser utilizadas.

Para la producción de levaduras secas activas (LSA) son necesarias las siguientes condiciones:

- Se realiza en condiciones de aerobiosis, es decir, en presencia de oxígeno, para conseguir una elevada biomasa. Las levaduras empleaban el ATP obtenido para reproducirse y así obtener esa gran masa de levaduras.

- En presencia de una reserva de ácidos grasos insaturados y esteroles muy necesarios para formar la membrana de la levadura. Los utilizarán las levaduras para poder seguir reproduciéndose durante el proceso fermentativo.

La síntesis de ácidos grasos insaturados y esteroles está inhibida durante la fermentación alcohólica, ya que para que se produzca se necesita la presencia de oxígeno. Por eso, es importante que las LSA los lleven incorporados.

- Su deshidratación: No todas las cepas resisten bien, ni mantienen sus características tras el secado. Así que, si la levadura no se puede deshidratar, no será una buena levadura para su uso industrial.

- Finalmente, para su conservación y para mantenerse perfectamente liofilizadas, las LSA deben permanecer a 4ºC y cerradas al vacío. Por lo tanto, mantener dichas condiciones es importante para que la rehidratación posterior sea óptima.


HIDRATACIÓN

Consejos para llevar a buen término la técnica de la rehidratación, ya que las LSA suponen dinero, un gasto, y, por lo tanto, debemos rentabilizar esa inversión. No sirve de nada, o nos servirá de poco, si las levaduras, en vez de activarse con la rehidratación se mueren.

Técnica de la rehidratación:
- Utilizar agua en cantidad 10 veces el peso de las levaduras a la temperatura de 37°C.
- Mezclar muy delicadamente y, luego, dejar rehidratar 20 minutos.
- Aclimatar el inóculo a la temperatura mediante la adición progresiva de mosto. Se debe tener cuidado de que la diferencia de temperatura, entre el inóculo y el mosto, no debe superar los 10 °C.
- Incorporar el inóculo al mosto con un remontado de homogeneización.
- La levadura seleccionada se utiliza en la cantidad de (de 20 a 40 g/Hl de mosto).

Tener en cuenta lo siguiente:
- La presencia de espuma no afecta a la eficacia de las levaduras y este factor, si se produce, nos indicará que la levadura presenta actividad. Pero si durante el proceso de la rehidratación no se produce espuma, nos indica que la levadura está muerta y no nos servirá para realizar la fermentación alcohólica.

Instrucciones que debemos seguir en su preparación:
- Se hidratan con agua. No utilizar mosto al inicio de la rehidratación, en esta fase, las levaduras secas no están preparadas para soportar las condiciones inhóspitas del mosto (levaduras salvajes, pH, temperatura, sulfuroso, azúcares, etc.). Deben activarse lenta y suavemente en el agua, que debe estar exenta de cloro.
- Controlar la temperatura del inóculo y del mosto: Las levaduras son muy sensibles a las variaciones de temperatura.
- Adaptar la dosis de levadura al mosto a inocular: Se considera dosis mínima 20 g/Hl. Aumentar la dosis en caso de: Vendimia alterada; Presencia recurrente o posible de Brettanomyces; Grado alcohólico potencial > 13 % vol.
- Si es necesario utilizar un protector de levadura: El cual, actúa a partir de la rehidratación proporcionando una protección que favorece a la levadura seleccionada al inicio y al final de la fermentación.
- Adicionar la levadura justo después del llenado del tanque: Para asegurar la buena implantación de las levaduras seleccionadas y su predominio, con respecto a la flora indígena, es preferible inocular lo antes posible. Así las levaduras seleccionadas evitarán tener una mayor competencia con la flora indígena; competencia en su lucha por los nutrientes, en definitiva; en su lucha por su supervivencia. Con esta medida se evita el desarrollo de dicha flora indígena.


DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA DE PIE DE CUBA

La finalidad del pie de cuba es:
Obtener una masa de levaduras autóctonas con las que se fermenten los mostos de cada vendimia e unifique las características de los vinos obtenidos. De esta forma se convierte en una buena solución para mantener las características típicas de los vinos de una región vitivinícola y, así, minimizar la pérdida de tipicidad de los vinos inoculados.

La técnica del pie de cuba consiste en:
- Consiste en seleccionar las mejores uvas y someterlas a una microvinificación.
- Utilizar una cantidad de ese caldo, como inóculo, para otros tanques de fermentación.
- Esos tanques de fermentación servirán, como inóculos, para otros futuros tanques.
- Es importante tomar el inóculo del tanque de la microvinificación casi, al final de la fermentación alcohólica, ya que entonces encontraremos la levadura Saccharomyces cerevisiae. Si lo hicieramos al inicio de la fermentación alcohólica nos encontrariamos con las levaduras de primera fase, entre ellas, las apiculatas, grandes productoras de volátil y por tanto no aptas.

Las ventajas del uso del pie de cuba son:
- Las levaduras obtenidas son específicas del área.
- Están totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona y a la materia prima, es decir, al mosto a fermentar.
- Son las responsables, al menos parcialmente, de las características de los vinos obtenidos.

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