martes, 17 de febrero de 2015

Las Bacterias Lácticas en el Vino



LAS BACTERIAS LÁCTICAS EN EL VINO

- Los géneros más frecuentes en el vino: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc y Oenococcus.

- El hábitat de las bacterias lácticas del vino:
Se encuentran de forma natural en las uvas, hojas, suelo y superficie de la maquinaria de la bodega. Además, tienen la capacidad de crecer en ambientes diversos, incluido el mosto de uva y el vino.

Al inicio de la fermentación alcohólica, se establece una competencia por los nutrientes entre las levaduras y bacterias lácticas, imponiéndose las levaduras. Al final de la Fermentación Alcohólica, las levaduras se quedan sin alimento y se autolisan, y es entonces cuando las bacterias lácticas comienzan a proliferar.

- Los factores que más influyen en ellas a la hora de realizar la fermentación maloláctica:
Principalmente, una temperatura baja, alto grado alcohólico, elevada acidez y alta dosis de sulfuroso dificultan el inicio y desarrollo de la fermentación maloláctica.

Características más significativas Las bacterias lácticas en el vino:
- Presentan morfología cocoide (redonda) o bacilar (como un bastoncillo).
- Son anaerobias facultativas y microaerófilas, lo cual significa, que son anaerobias facultativas porque pueden desarrollarse en presencia o ausencia de oxígeno. Y son microaerófilas porque la cantidad de oxígeno que precisan para poder desarrollarse es muy, muy pequeña.
- Necesitan como fuente de carbono principal a los carbohidratos, a los cuales fermentan por dos vías: homofermentativa y heterofermentativa. No son capaces de realizar un metabolismo oxidativo.
- El medio en el que se desarrollan debe contener aminoácidos, vitaminas e iones minerales (Mn2+, Mg2+, K+ y Na+) para poder proliferar. Son un poco golosas y exigentes.

Su población va cambiando, desde su presencia en el mosto de uva, hasta el final de la fermentación alcohólica:
- En los mostos de uva se encuentran presentes con una concentración aproximada de 104 cfu/mL.
- A lo largo y, sobre todo, al final de la fermentación alcohólica, el aumento en el contenido de etanol y la falta de nutrientes nitrogenados, agotados por las levaduras, hacen descender su número hasta 102 cfu/ml.
- Finalizada la fermentación alcohólica, las levaduras se autolisan liberando aminoácidos que servirán de nutrientes nitrogenados a las bacterias lácticas y, además, las propias bacterias lácticas se van adaptando a la alta concentración de etanol. Todo esto les permite su supervivencia y crecimiento hasta llegar a 106 cfu/ml, población, a partir de la cual, se considera que se inicia la fermentación maloláctica.


CLASIFICACIÓN

Además de sus formas cocoides o bacilares, el tipo de fermentación que utilicen con los carbohidratos, es un factor decisivo para su clasificación.

Respecto al uso de los carbohidratos pueden ser:
- Homofermentativas = Géneros: Pediococcus y Lactobacillus (Forma alargada de los lactobacilos y unión en cadenas). Las bacterias homofermentativas producen ácido láctico a partir de la glucosa y/o fructosa.
- Heterofermentativas = Géneros: Leuconostoc, Oenococcus y Lactobacillus.

Dentro del Género Lactobacillus, encontramos:
- Grupo I: homofermentativos estrictos (Lb. mali , Lb. yamanashiensis).
- Grupo II: heterofermentativos facultativos (Lb. plantarum, Lb. casei).
- Grupo III: heterofermentativos estrictos (Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. fermentum, Lb. fructivorans).

Las bacterias lácticas heterofermentativas producen: anhídrido carbónico, etanol y ácido acético, así como, ácido láctico a partir de la glucosa y/o de la fructosa.

Existen muchas especies de bacterias lácticas capaces de realizar la fermentación maloláctica en los vinos pero, las que realmente interesan desde el punto de vista enológico son:

- La especie Oenococcus oeni (antiguamente Leuconostoc oeni) es la que se utiliza para realizar la fermentación maloláctica.

. Soporta el rígido ambiente del vino, tolera altos niveles de alcohol, crece en vinos de pH bajo, etc.
. Convierte rápidamente el ácido málico en ácido láctico, sin producir aromas y gustos no deseados o metabolitos peligrosos.
. No degrada componentes del vino necesarios para la calidad y estabilidad de los vinos, como son: ácido tartárico, etanol o glicerina.

- Especies de Lactobacillus, Leuconostoc o Pediococcus pueden conducir la fermentación maloláctica, especialmente en vinos que presentan un pH superior a 3,5, ya que estos géneros son muy poco tolerantes a los pH bajos. El problema es que producen vinos no aptos organolépticamente, con aromas y sabores desagradables, así como elevados niveles de ácido acético. y altos niveles de aminas biógenas.

Como ejemplos de ellos, tenemos a Lactobacillus plantarum, que no produce cantidades significativas de ácido acético, pero tiene escasa tolerancia al etanol, con lo que no es un buen candidato, y Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus casei, y Lactobacillus brevis son más tolerantes al etanol, pero podrían producir mas ácido acético.


TIEMPO QUE PASA ENTRE LA FINALIZACIÓN DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA Y EL INICIO DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA

El intervalo de tiempo entre ambas fermentaciones dependerá de:
- La temperatura: Las temperaturas bajas retardan la fermentación maloláctica.
- El contenido de etanol: Un contenido elevado dificulta la fermentación maloláctica.
- La presencia de ciertos ácidos grasos sintetizados por las levaduras: Los ácidos grasos de cadena media como, hexanoico, octanoico, decanoico y dodecanoico, inhiben el crecimiento bacteriano.
- El nivel de sulfuroso: Altas dosis de sulfuroso dificultan, retardan o inhiben la fermentación maloláctica.
- El pH: Un pH bajo dificulta la fermentación maloláctica. Según el valor del pH, predominarán unas especies de bacterias lácticas u otras. Existen especies capaces de sobrevivir a pH bajos, particularmente, Oenococcus oeni, que es capaz de soportar la fermentación alcohólica y que, a menudo, se encuentra en vinos de pH inferiores a 3,5. Ésta es la especie que nos interesa que realice la fermentación maloláctica.

Los vinos que presentan pH superiores a 3,5 son capaces de contener una amplia gama de especies de bacterias lácticas como Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Pediococcus damnosus, Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc gracile. Estás especies no nos interesa que realicen la fermentación maloláctica, debido a los metabolitos indeseables que forman.

La fermentación maloláctica no sólo es un proceso de desacidificación biológica, también confiere un impacto significativo sobre las características organolépticas del vino, precisamente por los metabolitos que se forman.


MORFOLOGÍA

Las bacterias lácticas son organismos unicelulares, procariotas, heterótrofos. La célula procariota no posee núcleo, carece de estructuras internas asociadas a membranas, posee mesosomas, ribosomas y pared celular.

Forma: Puede ser cocos o bacilos.
- Cocos: Forma redonda, como un cero Ejemplo:
. Género Pediococcus: cocos agrupados en parejas o tétradas, nunca forman cadenas.
. Género Leuconostoc y Oenococcus: cocos agrupados en parejas y, más frecuentemente, en cadenas.
- Bacilos: Forma alargada, rectangular con extremos curvos. Ejemplo:
. Género Lactobacillus: forma de bastoncillo.

Tamaño: Oscila entre de 0,5 µ de diámetro y 10 µ de largo.

Otras características:
- Son Gram positivas: Según la composición de la pared celular, diferenciamos dos tipos de bacterias: Gram+ y Gram-. Ello depende de la coloración que adquieran con la Tinción Gram, de tal manera, que las denominadas Gram+ se tiñen de color azul y las denominadas Gram- se tiñen de color rojo.
- Catalasas negativas: No poseen la enzima catalasa, capaz de descomponer el agua oxigenada en agua y oxígeno. Por lo tanto, nos indica que no pueden poseer metabolismo oxidativo.
- No esporuladas.
- No tienen flagelos, por lo que son inmóviles.
- Anaerobias facultativas y además microaerófilas.
- Fermentadoras de azúcares (no respiran).
- Temperatura óptima de crecimiento 20°C-30°C.


FISIOLOGÍA. UTILIZACIÓN DE LAS HEXOSAS

Las bacterias lácticas obtienen energía a partir de los carbohidratos, pero utilizan un metabolismo fermentativo, nunca oxidativo, porque carecen de los sistemas citocromo y catalasa.

- En general, todas las bacterias malolácticas pueden utilizar un amplio grupo de carbohidratos, principalmente, pentosas y hexosas. Esta capacidad depende de las cepas de las especies implicadas, así como del pH del medio.

Utilizan las pentosas que les dejan las levaduras, porque éstas no pueden metabolizarlas. También metabolizan aquellos restos de hexosas, que puedan haber quedado al final de la fermentación alcohólica. Si la fermentación alcohólica se ha hecho bien, dichos restos deberán ser mínimos.

La disponibilidad y la utilización de carbohidratos fermentables del vino por las bacterias malolácticas es esencial para permitir el inicio del crecimiento bacteriano y la realización de la fermentación maloláctica ya que, mediante la fermentación de los mismos, se consigue el ATP necesario. El ácido málico no puede ser usado por las bacterias lácticas vínicas como única fuente de carbono, ya que se genera poco ATP.

Las bacterias lácticas, en general, pueden ser clasificadas como homofermentativas o heterofermentativas.

El metabolismo que utilizan las bacterias lácticas con las hexosas: Durante las rutas expuestas, es conveniente que las levaduras agoten, casi en su totalidad, a las hexosas para que, de este modo, las bacterias lácticas no las utilicen como fuente de carbono. Ya que si la cantidad de las hexosas es elevada, al consumirlas se produciría, sobre todo, un aumento de la acidez volátil, pues la principal bacteria responsable de la fermentación maloláctica es heterofermentativa.

- Homofermentativas: Pediococcus y Lactobacillus. Las bacterias lácticas homofermentativas utilizan la glucólisis como ruta de transformación de las hexosas, glucosa, formando, principalmente, ácido láctico. En esta ruta, se producen dos moles de ácido láctico y dos moles de ATP, por cada mol de glucosa fermentada.

- Heterofermentativas: Leuconostoc, Oenococcus y Lactobacillus. Por otra parte, los lactobacilos heterofermentativos, fermentan las hexosas a través de la ruta de la enzima fosfocetolasa.

. En esta ruta transforman la glucosa en CO2 y xilulosa 5-P.
. La xilulosa 5-P es desdoblada en 3-fosfogliceraldehído y en acetil-P con la intervención de la enzima fosfocetolasa.
. El 3-fosfogliceraldehído seguirá la ruta de la glicólisis y se transformara primero, en ácido pirúvico y, luego, en ácido láctico.
. El acetil-P puede originar etanol y acético.
. Los ATP generados son 2 ATP.


FISIOLOGÍA. UTILIZACIÓN DE LAS PENTOSAS

Las pentosas también seguen una ruta conocida como ruta de las pentosas.
- En esta ruta la xilulosa 5-P es desdoblada en 3-fosfogliceraldehído y en acetil-P con la intervención de la enzima fosfocetolasa.
- El 3-fosfogliceraldehído seguirá la ruta de la glicólisis y se transformará primero, en ácido pirúvico y, más tarde, en ácido láctico.
- El acetil-P origina ácido acético.
- Los ATP generados son 2 ATP.

Las pentosas son utilizadas por las bacterias heterofermentativas estrictas y, algunas heterofermentativas facultativas, que poseen la enzima fosfocetolasa. De esta forma las bacterias lácticas utilizan las pentosas y producen acético, pero también obtienen el ATP necesario para poder reproducirse. Posteriormente utilizarán el málico como fuente de carbono y lo transformarán en láctico. Al igual que las levaduras, las bacterias lácticas son seres vivos que, según los nutrientes que presente el medio, utilizarán unas rutas metabólicas u otras para poder sobrevivir, no “para hacernos el favor” de llevar a cabo la deseada fermentación maloláctica en nuestros vinos. Para ellas, es una simple cuestión de supervivencia.

Durante la fermentación maloláctica se produce un aumento de la acidez volátil entre 0,1-0,2 g/l que se considera normal. Dicho aumento proviene de la degradación de los azúcares residuales, pero también de la degradación del ácido cítrico.

La ruta de las pentosas se caracteriza por la intervención de la enzima fosfocetolasa. Esta ruta es utilizada por las bacterias malolácticas heterofermentativas estrictas y, algunas heterofermentativas facultativas, que poseen la enzima fosfocetolasa.

Las levaduras no son capaces de utilizar las pentosas ya que carecen de la enzima fosfocetolasa, sólo usan las hexosas.

Respecto a la ruta de las pentosas y las bacterias malolácticas:
- Homofermentativas: Enzima característica de la ruta de las pentosas.
- Heterofermentativas estrictas y algunas heterofermentativas facultativas: Tipos de bacterias malolácticas que utilizan la ruta de las pentosas.
- Fosfocetolasa: Tipos de bacterias malolácticas que no utilizan la ruta de las pentosas.


FISIOLOGÍA. UTILIZACIÓN DE OTROS NUTRIENTES

Además de los carbohidratos, las bacterias lácticas precisan de otros nutrientes para su desarrollo:

1. Utilización de una funete de Nitrógeno: Al igual que las levaduras, las bacterias malolácticas también necesitan una fuente de nitrógeno para formar sus proteínas y su propia constitución, poder desarrollarse y seguir viviendo.

Si las levaduras han agotado casi todo el nitrógeno que había disponible en el mosto. Las bacterias lo obtienen supuestamente, de la descarboxilación de los aminoácidos y oligopéptidos obtenidos de la autolisis de las levaduras, autolisis que ocurre una vez finalizada la fermentación alcohólica. Es un ejemplo claro del reciclaje de la materia, que ocurre en la naturaleza. Las bacterias malolácticas se "comen" los cadáveres de las levaduras.

En ocasiones, esta degradación conlleva la formación de productos no adecuados o, incluso, tóxicos como los siguientes:
- Aminas biógenas: Una de las aminas biógenas que se producen es la histamina que es una sustancia alérgena derivada de la histidina. Hay unos límites muy estrictos en aminas biógenas en los vinos y algunos países lo utilizan como barrera comercial.
- Ornitina y carbamato de etilo: Son derivados de la arginina. La primera, por descarboxilación, puede originar putrescina, compuesto con aroma a carne podrida, y el segundo es una sustancia con propiedades cancerígenas.
- El 2-acetil tetrahidropiridina: Se origina a partir de la lisina y posee un característico olor a ratón.

En los últimos años, se ha desarrollado una tecnología suficiente para impedir la formación de estos compuestos, en los vinos, durante la fermentación maloláctica.

2. Utilización del ácido cítrico como fuente de Carbono: El ácido cítrico es el tercer ácido en importancia y porcentaje del vino.

Las bacterias malolácticas utilizan el ácido cítrico mediante la siguiente reacción: El ácido ácido cítrico, por la acción de la enzima citrato liasa, se transforma en ácido acético y ácido oxalacético; éste se descarboxila y origina ácido pirúvico, el cual se vuelve a descarboxilar, por la acción de enzima α-lactato sintetasa, y origina el acetolactato, del cual, se consiguen productos interesantes como la acetoína, el diacetilo y el 2,3 butanodíol.

A un mosto, con poca acidez, no se le acidifica con ácido cítrico, porque lo podrían utilizar las bacterias lácticas como sustrato, durante la fermentación maloláctica, y elevarían las cantidades de acetoína, diacetilo, 2,3 butanodíol y ácido acético en cantidades importantes y originando, de este modo, un vino no apto organolépticamente.

3. Utilización de otros compuestos: Las bacterias malolácticas para su desarrollo necesitan vitaminas (ácido nicotínico, tiamina, biotina y ácido pantoténico), e iones minerales (Mn2+, Mg2+, K+ y Na+). Son un poco exigentes, además de golosas.


CONDICIONES DE DESARROLLO

La composición química del vino:
    
- El pH: Es uno de los principales factores que afectan al comportamiento de las bacterias lácticas en el vino y también ejerce una acción selectiva sobre las cepas de bacterias lácticas presentes. El pH crítico en los vinos esta por debajo de 3. Por debajo de este pH, es difícil llevar a cabo la fermentación maloláctica. La especie que más resiste la acidez es Oenococcus oeni. Cuanta más acidez tiene un vino, más necesario será llevar a cabo la fermentación maloláctica, pero más difícil será que se realice.

- El anhídrido sulfuroso (SO2): inhibe o impide el crecimiento de las bacterias lácticas, pero la sensibilidad de éstas al SO2 varía según las especies y cepas. El efecto inhibidor del anhídrido sulfuroso es superior a pH bajo, ello es debido, a que el sulfuroso se encuentra en su forma molecular activa SO2.

- El grado alcohólico: A medida que aumenta más inhibidas se encuentran las bacterias lácticas, siendo el 14% vol la concentración máxima tolerada por la mayor parte de las cepas.

Las condiciones físicas de desarrollo:

- La temperatura: El ritmo de crecimiento bacteriano y la velocidad de la fermentación maloláctica se encuentran inhibidos, de forma importante, por las bajas temperaturas. Ello es debido a que las bacterias malolácticas son mesófilas. Su temperatura óptima de crecimiento se encuentra entre 15°C y 30°C. Ello obliga a muchas bodegas a controlar su propia temperatura, bien calentando o enfriando el ambiente, bien con control automático en depósitos isotermos, o por cualquier otro sistema.

Las prácticas enológicas:

- La clarificación de los mostos y los vinos: Puede disminuir una gran parte de bacterias malolácticas y algunos nutrientes que son necesarios para el crecimiento bacteriano.

- La termovinificación: Aplicada a los vinos, es una técnica que si se utiliza no favorece la fermentación maloláctica. Ello es debido a que el calor aplicado al vino destruye nutrientes y elimina a las bacterias malolácticas. Posteriormente a la termovinificación, se deberá inocular y añadir los nutrientes necesarios, para que tenga lugar la fermentación maloláctica.

Las interacciones con otros microorganismos:

Durante la vinificación existe la posibilidad de interacciones entre:
Las bacterias lácticas y las levaduras.
Las bacterias lácticas y los hongos.
Las bacterias lácticas y las bacterias acéticas.
Las bacterias lácticas y los bacteriófagos.
Especies y cepas de las propias bacterias lácticas.

- El efecto de las levaduras. Poseen un efecto antagónico que se considera que es debido a la competencia por los nutrientes y a la producción de sustancias que inhiben el crecimiento bacteriano, como son: el SO2 o los ácidos grasos de cadena media. Por otro lado, las levaduras, durante su autolisis, ejercen un efecto positivo sobre las bacterias malolácticas. Durante, la autolisis de las levaduras, se liberan vitaminas y aminoácidos en el vino. Esto, sin duda, da lugar a un enriquecimiento de nutrientes y a la consiguiente estimulación de la fermentación maloláctica.

Una levadura puede producir SO2, en la ruta de reducción de sulfatos, ruta que la levadura utiliza para obtener azufre y sintetizar los aminoácidos azufrados metionina y cisteína.

- El efecto de las sinergias y antagonismos entre las distintas especies bacterias malolácticas: La que más interesa es la que se lleva a cabo con Oenococcus oeni. Como ejemplo de ello, diversos estudios han confirmado que el crecimiento de Pediococcus ssp se estimula por una muerte rápida de Oenococcus oeni y, en condiciones de pH bajo, el crecimiento precoz de Lactobacillus brevis podría inhibir completamente el crecimiento de Oenococcus oeni.

Los tipos de vinos donde es más interesante realizar la fermentación maloláctica y ademmás es una práctica general, es en vinos tintos destinados a crianza y en blancos, de elevada acidez. También existen otros casos muy especiales como, por ejemplo: la fermentación maloláctica en barrica, la fermentación maloláctica en vinos verdes de la región galaico-portuguesa del Miño y la que se produce en el vino tinto Beaujolais.





Fotografías: 
- Autoría: J.A. Suárez Lepe, B. Íñigo Leal. Procedencia: Libro "Microbiología enológica". Fundamentos de vinificación.partido madird ISBN: 84-8476-184-3.
- Autoría: Faculté d´Enologie de Bordeaux, Grupe Lamothe Abiet, Spriger Enologie, DSM Food specialities, Sarco. Procedencia: Guía práctica: Las fermentaciones d elevaduras y bacterias.
-  Autoría: Bernard, Claude; Agay, Bernard; Asselin, Christian. Coordinador: Claude Flanzy. Procedencia: Libro "Enología: Fundamentos científicos y tecnológicos". ISBN: 2-7430-0243-3.

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