jueves, 12 de marzo de 2015

Usos Tecnológicos de las Enzimas Enológicas



USOS TECNOLÓGICOS DE LAS ENZIMAS ENOLÓGICAS

Presentes naturalmente en todo ser vivo las enzimas son unas proteínas que facilitan y aceleran las transformaciones de moléculas específicas en otras moléculas con propiedades diferentes.

Las enzimas más importantes desde el punto de vista enológico son las enzimas de maceración. Como ejemplo de ellas tenemos a las enzimas pectinolíticas o pectinasas (que atacan a las pectinas), celulasas (celulosa), β-glucanasas (glucanasa), glicosidasas (osidasa), hemicelulasas (hemicelulosa) etc. Sin ellas no se produciran las reacciones bioquímicas.

La actividad, muchas veces, coincide con el nombre de la enzima. Decimos enzima pectolítica y actividad pectolítica o enzima cimanil-esterasa y actividad cimanil-esterasa y, a veces, alguna enzima como las pectolíticas presentan más de una actividad, en concreto ésta tiene tres.

Usos Tecnológicos de las Enzimas Enológicas:
- Las enzimas, en cuanto a la relación coste-efectividad, son muy eficientes y constituyen una herramienta segura para mejorar la calidad de los vinos tintos.
- La elección adecuada de la enzima y la dosis a emplear según, (grado de maduración y variedad de uva, condiciones de pH y temperatura del medio, concentración y perfil de actividades enzimáticas, etc.), son aspectos importantes que no se deben perder de vista.
- Las enzimas del mercado son muy diferentes unas de otras. Por lo tanto, es muy importante ampliar conocimientos de los productos enzimáticos disponibles actualmente en el mercado.
- En vinificación, es necesario conseguir un buen conocimiento en la combinación de utensilios biológicos a utilizar, refiriéndonos, no sólo a las enzimas, sino también, a cepas de levaduras, cepas bacterias y, cómo no, a los nutrientes. Debemos, por tanto, desarrollar una tecnología de vinificación integrada.

Las preparaciones enzimáticas en enología constituyen una herramienta de precisión tanto para resolver problemas tecnológicos de desfangado o prensado como para sacar el máximo aprovechamiento de las cualidades de la uva en términos de aroma y color. La adecuada combinación de las distintas actividades enzimáticas permite valorizar y rentabilizar rendimientos de mostos y vinos.

Se distinguen tres grupos de preparaciones enzimáticas, en función de su actividad principal:
- Enzimas pectolíticas: Ideal para utilización a bajas temperaturas o maceración pelicular.
- Enzimas para la extracción de aromas: Liberación de precursores aromáticos y utilización en vino para liberación de precursores terpénicos y nor-isoprenoides que se encuentran en formas no odorantes.
- Enzimas para extracción de color: Producen un incremento de estructura y estabilidad en los mostos y vinos tratados debido a la extracción compensada de polifenoles.

En la actualidad existe una industria importante dedicada a la producción y venta de enzimas para diversos usos, como son:
- Procesado de muchos alimentos: En quesos, pan, cerveza y, aunque no sean alimentos, también las encontramos en los detergentes; con ellos quitamos las manchas de grasa, de proteínas, etc.
- Realización de análisis por métodos enzimáticos: Con ellas, se pueden cuantificar componentes del vino como etanol, glicerol, ácido málico, ácido acético y otros. También se utilizan para comprobar la desaparición del ácido málico y la aparición del ácido láctico durante la fermentación maloláctica.

- Empleo de enzimas de vinificación: Con ellas, se consigue extraer compuestos polifenólicos y aromáticos que aumentarán el color y aroma de los vinos. También facilitan la clarificación y filtración de los mismos, al disminuir el tamaño de las partículas coloidales y facilitar su sedimentación.


ENZIMAS DE MACERACIÓN

Las enzimas más importantes de la maceración son: Entre las pectinasas, se distinguen las actividades: poligalacturonasa, pectin-metil-esterasa ytranseliminasa. En Enología, otras enzimas que se encuentran presentes en las preparaciones enzimáticas comerciales son: celulasa, hemicelulasa, β -glicosidasa, etc. Con todas ellas, se consigue extraer más color, más aromas, mejorar la filtración, etc.

Se conocen como enzimas de maceración a un conjunto de enzimas formados principalmente por:
- Pectinasas, celulasas y hemicelulasas. Llevarían a cabo las actividades principales.
- β-Glicosidasa, ramno-galacturonasa, proteasa, cinamil-esterasa, etc. Llevarían a cabo actividades secundarias.

La enzima cinamil-esterasa, realiza una actividad secundaria no interesante ya que queda como contaminante en el conjunto de enzimas a las que acompaña, sobre todo, en los cócteles enzimáticos de maceración que contienen pectinasas, y no interesa que esté presente ya que en presencia de la levadura Brettanomyces produce etil-fenoles (con aroma a sudor de caballo, caucho, etc.) que deprecian el aroma del vino. Las casas comerciales en su intento de purificar los enzimas tratan de eliminarla o al menos reducirla. Otra actividad secundaria contaminante sería la antocianidasa que degradaría a los antocianos.

Las funciones generales de las enzimas de maceración son:
- Disminuir la viscosidad del mosto-vino. Para ello rompen las grandes cadenas en unidades o fragmentos más cortos, lo que facilita la clarificación y filtración.
- Incrementar las velocidades de clarificación y sedimentación, debido precisamente a esa ruptura.
- Degradar de los polisacáridos de las paredes celulares del grano de uva que podrán unirse a los antocianos y taninos y estabilizarlos.
- Mejorar extracción del color de los vinos tintos debido a que se desprenden con mayor facilidad los antocianos del hollejo de la uva.
- Aumentar el aroma y el sabor ya que se desprenden con mayor facilidad los compuestos aromáticos y sápidos del hollejo de la uva.
- Mejorar el envejecimiento debido a incrementos en taninos, los cuales, establecen uniones estables con los antocianos y evitan que se oxiden o floculen.

La actuación del sulfuroso, el alcohol y las acciones mecánicas de remontados y bazuqueos ayudan en la extracción de esos compuestos de la uva. Las enzimas de maceración, en una de sus funciones, extraen, lo más rápidamente posible, los compuestos polifenólicos de la uva. Ello supone una presencia simultánea de antocianos y taninos que posibilitará una polimerización cruzada entre ellos y, por consiguiente, su estabilización, mejorando, de este modo, el color y la astringencia del vino.

Distintas actividades de las enzimas de maceración: Pectinasas, ramno-galacturonasa celulasas y hemicelulasas. β-glicosidasa, proteasa y cinamil-esterasa.

-  Actividad pectolítica: La enzima pectinasa o pectinolítica degrada exclusivamente la pectina. Se dice que tiene actividad pectolítica porque rompe las pectinas.

Es necesaria para la clarificación del mosto en blancos, ya que las pectinas mantienen en suspensión otras partículas que deseamos eliminar del mosto, sobre todo, para la obtención de vinos blancos y rosados de calidad. Esta acción es también importante durante la maceración de tintos, porque participa en la ruptura de la pared de las células vegetales permitiendo una mayor salida de color y aromas.

- Actividad ramno-galacturonasa: Escinde la cadena lateral de la pectina. Se trata de una actividad complementaria a la pectinasa. Libera al mosto polisacáridos importantes (de cara a la sensación en boca y la estructura de los vinos). Se unirán a los taninos y formarán los llamados taninos dulces. Dicha unión es estable.


Algunas Enzimas Presentan una Sola Actividad Mientras que Otras Tienen Varias:

- Actividad celulasa y hemicelulasa: Consiste en la ruptura de la celulosa y la hemicelulosa, ambas refuerzan la estructura de la pared vegetal. La ruptura de dicha pared mejora la extracción del contenido celular, tanto en volumen, como en solutos y moléculas en suspensión. La celulosa es una larga cadena de glucosas unidas con enlace β (1→4).

La hemicelulosa está formada por un conjunto heterogéneo de polisacáridos. Están formados por un solo tipo de monosacáridos unidos por enlaces β (1→4) que forman una cadena lineal de la que salen ramificaciones cortas formadas por monosacacáridos diferentes, fundamentalmente xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, glucosa y ácido glucurónico.

Los taninos mejor valorados son los que se encuentran dentro de la pared celular vegetal, por lo que es importante degradar las celulosas y hemicelulosas, para que puedan ser extraídos.

- Actividad beta-glicosidasa: Libera las moléculas aromáticas ligadas, tipo terpenos, norisoprenoides y fenoles volátiles, apareciendo aromas propios de cada variedad. Debido a su acción, estas moléculas llegan a ser volátiles y odorantes y, por tanto, a ser percibidas por nuestro olfato.

- Actividad proteasa: Actúa sobre las proteínas de membrana y mejora la extracción del contenido celular. Su acción es complementaria a otras actividades, sola sirve de poco. No es eficaz contra las proteínas que causan la inestabilidad proteica del vino.

- Actividad cinamil-esterasa: Hidroliza los ésteres de ácidos cinámicos, como el ácido hidroxicinamil-tartárico. De esta manera, forman ácidos cinámicos que mediante la acción de la cinamato-descarboxilasa de algunas levaduras llevan a la formación de vinil-fenoles, éstos, en presencia de la levadura de contaminación Brettanomyces, pueden ser transformados en etil-fenoles volátiles, los cuales muestran aromas de gomas, caucho, farmacéuticos y de sudor de caballo. Además tienen un umbral de detección olfativa muy bajo.

No interesa en absoluto que el preparado enzimático comercial que se obtenga posea esta actividad. Para eliminar las cinamil-esterasas de los preparados enzimáticos comerciales, se utliza la ultrafiltración, debido a que tienen una masa molecular de 120 Kda., muy distinta a la de las pectinasas (25 – 50Kda). La actividad cinamil-esterasa está presente de forma natural en la mayoría de las pectinasas producidas por Aspergillus niger, aunque presentan diferencias respecto a la cantidad.

La presencia de cimanil esterasas puede incrementar la concentración de vinil-fenoles en vinos y, si hay riesgos de contaminación por microorganismos, como la levadura Brettanomyces, capaces de convertirlos en etil-fenoles, es mejor utilizar enzimas libres de esta actividad.

Este es un ejemplo de enzimas comerciales que no presentan esta actividad:
- Depectil Extraction: Para los vinos tintos redondos. Preparación enzimática para la extracción de los antocianos y los polifenoles. Dosis de 1-4 g/100 kg.
- Depectil Extraction FCE: Existe también una preparación exenta de cinamil esterasa. Dosis de 1-4 ml/100kg o 1-4g/100kg.


El Mejor Momento para Añadir las Enzimas de Maceración y Cómo Hacerlo:

Lo mejor es añadirlas al principio de la maceración, en el encubado, después de la adición del sulfuroso.

Se hará de la siguiente manera:
- Diluir la enzima en una pequeña cantidad de agua fresca o mosto.
- No remover vigorosamente.
- Añadir tan pronto como sea posible.
- Preparar cada día una solución fresca de enzimas.

Las dosis recomendadas:
- Depende de la concentración del producto enzimático, tipo de aplicación y calidad de las uvas.
- La dosis media sugerida es de 2 g/hl, pero hay que seguir las instrucciones del fabricante.

Las enzimas son inhibidas por otros aditivos:
- La bentonita, por ejemplo, es un fuerte inhibidor de las enzimas, por lo que no se pueden utilizar al mismo tiempo. La bentonita tiene carga – (negativa) y las proteínas (enzimas) carga + (positiva), al unirse ambas la acción de la enzima queda anulada. También hay que tener en cuenta que la bentonita es un clarificante que arrastra tanto compuestos cargados positiva como negativamente.
- El sulfuroso, a dosis normales, no inhibe la actividad de las enzimas, sin embargo, no se deben preparar las soluciones de sulfuroso y enzimas al mismo tiempo, no en vano, el sulfuroso tiene acción antioxidásica.

La enzima a elegir:
- Es difícil realizar una buena elección de la enzima a utilizar, sino se dispone de la información suficiente para conocer a fondo la enzima elegida. Por eso deberiamos comparar diferentes casas comerciales.

Manejo:
- Las enzimas pueden causar sensibilización por inhalación. La mayoría están disponibles en forma micro-granulada para disminuir los riesgos sobre la salud del usuario. Durante el manejo de las mismas, debemos evitar respirar el polvo cuando se abren los paquetes, por lo que es aconsejable usar mascarilla, así como gafas y guantes.

Almacenaje:
- En corto periodo de tiempo ( < 1  año ), se almacenará a temperatura por debajo de 25°C.
- Para largos periodos de tiempo (1-3 años), se almacenará a temperatura por debajo de 5°C. Siempre que sea posible, debemos mantener guardados los paquetes sin abrir. Si están abiertos, los cerraremos adecuadamente.

Las enzimas no actúan indefinidamente:
- La acción de la enzima modifica el estado físico de la estructura del hollejo, por tanto, la extracción sucesiva en fase alcohólica se facilita. Posteriormente, y a lo largo de la maceración, la concentración de antocianos bloquea la acción de las enzimas.


Las Enzima Pectosíticas son enzimas de maceración que atacan, rompen, a las pectinas:

- Pectinas: Las pectinas son polímeros del ácido galacturónico con enlaces α (1→4). Presentan metilaciones, en mayor o menor grado, en el carbono nº 6. Así, distinguiremos pectinas de alto grado metoxilo si el número de metilaciones es grande, o de bajo grado metoxilo si el número de metilaciones es pequeño. Además, presentan intercalados otros monosacáridos, como la ramnosa, de los que surgen ramificaciones.

El tipo de unión que presentan las metilaciones en el carbono número 6 del ácido galacturónico, son uniones éster entre el grupo ácido –COOH del carbono 6 y el metanol.

- Aparecen en el mosto: Porque las pectinas forman el cemento que une las paredes celulares del hollejo y pulpa de la uva y, por tanto, serán extraídas al mosto.

- Nos interesa: Desde el punto de vista enológico eliminarlas porque su degradación favorece enormemente la extracción de los compuestos fenólicos que nos aportan color rojo, y también de los aromas del hollejo de la uva que, de este modo, tendremos muchos más. Además su eliminación, favorece la clarificación y filtración de los vinos.

- Pude ser conveniente añadir enzimas pectolíticas comerciales: En la uva, están presentes las enzimas pectolíticas, pero prácticamente no son activas en las condiciones de vinificación.

Las enzimas comerciales son producidas por el hongo “Aspergillus” y son resistentes a esas condiciones, lo que justifica su uso. La utilización de las mismas, puede mejora la vinificación, por reducir el tiempo de maceración, fermentación y maduración de los vinos.



Mecanismo de acción y actividades principales de las enzimas pectolíticas:

a. Pectinesterasa o pectin- metil-esterasa: Esta actividad de la enzima consiste en romper, mediante hidrólisis, el enlace éster –COCH3 del carbono 6 del ácido galacturónico. Se restablece el grupo –COOH y se libera metanol CH3OH.

R-COOH3 + H2O → R –COOH + CH3OH (metanol).

No interesa que la enzima pectinolítica posea la actividad pectin-metil-esterasa. Ya que se libera metanol que es un compuesto tóxico. Por tanto, las preparaciones comerciales de enzimas pectolíticas, muy concentradas en la actividad pectín-metil-esterasa, no son recomendables en enología. Existe una reglamentación muy restrictiva, en cuanto a las concentraciones máximas de metanol en el vino, que debemos cumplir.

b. Pectinasa o poligalacturonasa: Se produce una hidrólisis de pectinas desmetiladas en el enlace α (1→4) del ácido galacturónico interno obteniéndose cadenas poligacturónicas de diversos tamaños (pectinas de menor tamaño). Según la zona de ataque en la cadena pectídica, se distinguen: Endo-PG, la enzima ataca por la parte interna de la cadena pectídica, y Exo-PG, la enzima ataca por los extremos de la cadena pectídica.

c. Endopectina liasa o transeliminasa: En este caso, las enzimas, que presentan esta actividad, despolimerizan pectinas metiladas rompiendo el enlace α (1→4), sin la participación del agua.

También hay que tener encuenta que no todas las enzimas pectolíticas comerciales presentan estas tres actividades. Existe una gran variedad en el mercado dependiendo del tipo de vino de que se trate. De todas formas nos interesa que no tengan la pectinesterasa o pectin-metil-esterasa o que ésta sea mínima.

Estas actividades son complementarias, así un elevado nivel de poligalacturonasa es muy eficaz en clarificación, pero se precisa también de la acción de la enzima liasa o transeliminasa. De este modo, con estas dos actividades, se romperá toda la cadena poligalacturónica, la metilada y la no metilada, y de una forma rápida.

Es recomendable utilizar enzimas comerciales con alto contenido en liasa-transeliminasa además de la actividad poligalacturonasa-pectinasa cuando se requieran desfangados muy rápidos, porque de esta manera se evitará la oxidación del mosto y el desarrollo de la microflora salvaje. Además el desarrollo de esta ultima, llevará asociado la disminución de los nutrientes del mosto, ya que dicha microflora consumiría una parte de ellos.



β-GLUCANASAS

La importancia que tiene la elaboración del vino con uva sana es fundamental, pero en ocasiones, nos podemos encontrar con uvas atacadas por Botrytiscinerea. En este caso, se sulfita más esa uva, se evita la presencia de oxígeno, etc., y también se puede hacer uso de las enzimas glucanasas.

El sustrato al que atacan las enzimas β-glucanasas, es el β-glucano. El glucano es un polímero lineal de glucosa con enlace β (1→3) y que presenta ramificaciones en β (1→6). No está presente en uvas sanas y, sí es habitual en uvas atacadas por Botrytis cinerea, ya que las paredes de este hongo contienen β-glucanos. También encontramos estos compuestos en la pared celular de las levaduras.

La pared celular es una envoltura exterior de la levadura que aísla al microorganismo del medio que le rodea. De naturaleza esencialmente polisacárida, se compone de polisacáridos y manoproteínas (35 %) entramadas mediante fibras de glucano β-(1→3)glucanos y β-(1→6) glucanos, 25 % y 4 %, respectivamente) y quitina (1-2 %).

Desde el principio de la autolisis, las actividades de una exo y de una endo β-(1-3)-glucanasas liberan una mezcla de polisacáridos y cortas cadenas oligosacáridas y, también, a las manoproteínas que estaban verdaderamente unidas al glucano en la pared intacta.

Estos glucanos presentes en la pared celular, son degradados por las glucanasas de la levadura durante su autolisis, liberando compuestos beneficiosos para el vino.

Sin embargo, los glucanos procedentes de la Botrytiscinerea aumentan la viscosidad en el mosto-vino. Dificultando las prácticas enológicas del desfangado, la clarificación y la filtración, por ese aumento de viscosidad en el mosto-vino.

Existen preparados comerciales de glucanasas.
Por ejemplo la enzima comercial Glucanex, es una β-glucanasa que hidroloza los enlaces β (1→3) y β (1→6) de los glucanos generados por Botrytis cinerea. Esta enzima se puede utilizar para vinos tintos, blancos y rosados a una dosis de 0,1-1g/Hl.




β-GLUCOSIDASAS

Para entiender la actividad glicosidásica de la enzima β-Glicosidasa hay que saber que los componentes responsables del aroma de las uvas constan de: compuestos volátiles libres y compuestos volátiles conjugados.

Los compuestos volátiles libres liberan sus correspondientes aromas, y nuestro sistema olfativo es capaz de percibirlos. No ocurre lo mismo con los compuestos volátiles conjugados (ligados), en este caso, los compuestos aromáticos están unidos a otras moléculas y no manifiestan sus propiedades odoríferas.

Las moléculas aromáticas más importantes son: terpenos, norisoprenoides y fenoles volátiles.

Los terpenos son uno de los compuestos volátiles más importantes. Desde el punto de vista químico, son compuestos hidrocarbonados con función alcohol.

Existen tres tipos:
- Un primer grupo que lo forman los terpenos libres como son el linalol, geraniol y nerol, y cuyo aroma podemos percibir.
- Un segundo grupo lo constituyen los polialcoholes o formas polihidroxiladas de estos monoterpenos, que no contribuyen directamente al aroma del vino.
- Por último, están las formas glicoconjugadas de los monoterpenos, que tampoco son volátiles debido a su estructura. Estas formas, que son terpenos unidos a moléculas de glucosa, son, en la mayoría de los casos, las formas más abundantes de los tres tipos descritos y se conocen como precursores del aroma.

La β-Glicosidasa actúa: Liberando las moléculas aromáticas (terpenos, norisoprenoides y fenoles volátiles) que se encuentran ligadas, apareciendo los aromas propios de cada variedad. Por consiguiente, estas moléculas llegan a ser volátiles y odorantes.

La separación del azúcar del terpeno se produce:
Por que los terpenos ligados a azúcares están unidos con el carbono nº 1 del azúcar. Se unen a través de los grupos OH de ambos. La enzima glicosidasa rompe esa unión mediante una hidrólisis, obteniéndose por un lado, el terpeno libre y, por el otro, el azúcar.

Podemos encontrar a la β-Glicosidasa:
La β-Glicosidasa no se encuentra presente en la uva. Sin embargo, existen levaduras, tanto seleccionadas como indígenas, que son capaces de liberar este tipo de enzimas al mosto-vino, durante la fermentación alcohólica. La capacidad de liberación de esta enzima cambia, no sólo a nivel de especie, sino también, de cepa. Existen especies de levadura, no Saccharomyces, con elevada producción de β-glicosidasa y, dentro de la especie Saccharomyces cerevisiae, se manifiestan diferencias entre las diferentes cepas.

Respecto a las bacterias malolácticas:  Presenta esta actividad Oenococcus oeni. En efecto, durante la fermentación maloláctica, debido a que numerosos antocianos, (moléculas glicosiladas presentes en la uva tinta), las ß-glucosidasas podrían, en teoría, degradar estos pigmentos y conllevar una disminución de la coloración roja del vino. También actuarían sobre los terpenil glicósidos del vino, liberando los terpenos y, por tanto, aumentando la fracción aromática.



ENZIMAS COMERCIALES

Las enzimas comerciales son auténticos cócteles enzimáticos “a la carta”. En la actualidad se conoces sus funciones. Podemos considerar que, durante la vinificación, las enzimas consiguen extraer, de la manera más rápida posible, los compuestos más interesantes para el color (antocianos), el cuerpo y la estructura de los vinos (taninos) y los aromas. Además. También facilitan el desfangado, la clarificación y la filtración.

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