viernes, 24 de abril de 2015

Recuento de Levaduras en Enologia



RECUENTO DE LEVADURAS EN ENOLOGIA

La levadura más frecuente en enología es Saccharomyces cerevisiae (hongo unicelular eucariota de 2-10 µm de tamaño) que suele ser el principal responsable de la fermentación alcohólica y de la generación de aromas secundarios en el vino.

El recuento de levaduras se realiza en el control de los vinos, pero de forma más generalizada en “pie de cuba” y en el “tiraje” para la elaboración de vino espumoso. Asimismo por medio de tinciones adecuadas se pueden identificar las levaduras viables.

El recuento de levaduras totales y viables se realiza por microscopía mediante la tinción con azul de Evans y/o azul de metileno.


- La finalidad del pie de cuba es:  Obtener una masa de levaduras autóctonas con las que se fermenten los mostos de cada vendimia e unifique las características de los vinos obtenidos. De esta forma se convierte en una buena solución para mantener las características típicas de los vinos de una región vitivinícola y, así, minimizar la pérdida de tipicidad de los vinos inoculados.

Consiste en seleccionar las mejores uvas y someterlas a una microvinificación. Utilizar una cantidad de ese caldo, como inóculo, para otros tanques de fermentación. Esos tanques de fermentación servirán, como inóculos, para otros futuros tanques. Es importante tomar el inóculo del tanque de la microvinificación casi, al final de la fermentación alcohólica, ya que entonces encontraremos la levadura Saccharomyces cerevisiae. Si lo hicieramos al inicio de la fermentación alcohólica nos encontrariamos con las levaduras de primera fase, entre ellas, las apiculatas, grandes productoras de volátil y por tanto no aptas.

Las ventajas son que las levaduras obtenidas son específicas del área. Están totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona y a la materia prima, es decir, al mosto a fermentar. Son las responsables, al menos parcialmente, de las características de los vinos obtenidos.


- La finalidad del licor de tiraje es: Conseguir en la elaboración de vinos espumosos un ambiente anaerobio, una segunda y lenta fermentación en la botella, quedando el carbónico encerrado y disuelto en el vino. Esta segunda fermentación se efectúa a la temperatura de 11-12ºC. Es lenta y dura algunas semanas, a veces incluso algunos meses.

Una vez que se consigue el ensamblaje adecuado, se introducen en botella junto con un jarabe de azúcar (licor de tiraje), levaduras seleccionadas y elementos coadyuvantes, como clarificantes, taninos, etc.

La adicción de un licor de tiraje con 24 a 26 g de azúcar por litro, adición de levaduras, 1.000.000 por cm3 y tiraje en botellas.


Material y reactivos:
- Microscopio de 600-900 aumentos.
- Cámara de recuento Thoma o Neubauer.
- Cubreobjetos.
- Pipeta semiautomática de volumen variable de 100 µL.
- Pipeta semiautomática de volumen variable de 1000 µL.
- Microtubo de µL.
- Agua PA-ACS, Código 131074.
- Etanol 96% v/v PA, Código 121085.
- Azul de Evans DC, Código 255486.
- Azul de Metileno Fenicado según Khilne DC, Código 251172.

- Portaobjetos de las cámaras de recuento Thoma y Neubauer: portaobjetos de ≈5mm de grosor con 4 ranuras transversales y 1 perpendicular para recoger el líquido sobrante. En el segmento central rebajado 0,1mm, se encuentran grabadas las 2 cuadriculas de recuento con ligeras variaciones entre ellas.


PROCEDIMIENTO

Todo el material de vidrio que se utilice ha de ser lavado con agua destilada y alcohol del 96%.

Se colocan 400 µL de muestra homogeneizada en un microtubo y se añaden 40 µL de azul de Evans o azul de metileno fenicado. La muestra y el colorante se mezclan y se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 5 min. Se deposita una gota en una de las 2 cuadrículas del portaobjetos procurando que quede llena la superficie y se tapa con el cubreobjetos evitando la presencia de burbujas de aire. La cámara de recuento se ha de fijar en la platina del microscopio para realizar la observación microscópica.

El enfoque del microscopio se empieza con un objetivo de pocos aumentos que posteriormente pasaremos a uno de más. Se coloca el objetivo lo más cerca posible del cubreobjetos pero sin tocarlo y posteriormente se irá alejando hasta que la imagen sea lo más clara y nítida posible.

Sea cual fuese el modelo de cámara empleado, el procedimiento es el mismo, el recuento se realizará sobre 20 de los 400 (20 x 20) cuadrados pequeños de 0,0025 mm2 (volumen total de 0,1 mm3) elegidos al azar. Si el número de células/cuadrado es >10 es conveniente diluir la muestra.

Detalle del cuadrado de la cámara de recuento de Thoma

Por convenio para evitar contar dos veces la misma levadura, consideraremos que las levaduras que se encuentren en la intersección de una cuadrícula se apuntarán a la de abajo y a la de la izquierda, y las gemaciones se cuentan como 1/2 levadura.

Las levaduras vivas se pueden diferenciar de las muertas porque el azul de Evans colorea las células viables mientras que el azul de metileno sólo colorea las no viables. Sea n el número total de levaduras en las 20 cuadrículas.

Bibliografía:        
- Técnicas Usuales de Análisis en Enología. (J. Garcia - M. Xirau).
- Delfi C. Scienza e tecnica di microbiologia enologica. 33-55 (1995).
- Ministeriio de Sanidad y Consumo. Instituto Nacional de Sanidad. Técnicas para el análisis microbiológico de alimentos y bebidas del Centro Nacional de Alimentación y Nutrición. 16-17(1982).

No hay comentarios:

Publicar un comentario