miércoles, 22 de abril de 2015

Recuento de Levaduras Totales e Identificación de una Cepa Aislada en Vinos



1.- RECUENTO DE LEVADURAS TOTALES

Fundamento: Para el recuento de levaduras totales (viables + muertas) se utiliza la cámara de Neubauer. La cámara de Neubauer es una cuadricula de 256 cuadraditos (16x16). Cada cuadradito tiene una capacidad de 0.00025 mm3 (0.0025 mm2 x 0.1 mm). Este método permite realizar recuentos  y nos da un número aproximado de UFC/ml.

Material:
- Suspensión de levaduras cuyo recuento se pretende realizar
- Cámara de Neubauer
- Microscopio
- Agitatubos
- Micropipeta


Método:
- Homogeneizar la suspensión de levaduras cuyo recuento se pretende determinar.
- Depositar sobre la cuadricula de la cámara 2 gotas de suspensión. Cubrir la cámara con el cubreobjetos con cuidado de no producir burbujas de aire.
- No es necesario contar todos los cuadraditos, se van a contar en diagonal, 16 cuadraditos en una cámara de 256, y 20 cuadraditos en una cámara de 400.


Para realizar el contaje hay que tener en cuanta unas normas para evitar errores:
1.- Las células que están sobre las líneas horizontales de los cuadrados se consideran del cuadrado inferior. Si están en las líneas verticales se consideran del cuadrado de la derecha. Las gemaciones se consideran como media levadura.
2.- El número de levaduras por cuadradito se encontrará en un rango de fácil recuento (5-7 levaduras)
La limpieza de la cámara se realizará con sumo cuidado con agua destilado estéril.

Calculos:
- N, son la levaduras que hay en 20 cuadraditos
- (Nx20), ufc en toda la cámara
- La capacidad de la cámara de 400 cuadraditos es de 0,1 mm3

Nº levaduras/ml: (Nx20)/0,1 mm3 x1000 mm3 / cm3x dilución


2.- IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS DE UNA CEPA AISLADA EN VINOS

Con las levaduras problema se realizará una suspensión en un tubo con agua destilada estéril  que se utilizará para inocular los diferentes medios de identificación.

1.- CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

- Observar las características macroscópicas del cultivo de levadura en medio sólido y en medio líquido.
- Para la observación microscópica se observa al microscopio óptico una suspensión de esas levaduras. Se puede realizar un fresco y una tinción simple.
- Se anotarán las siguientes características: forma, tamaño, tipo de agrupación celular, ascosporas, reproducción vegetativa etc…


2.- CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS

2.1.- FORMACIÓN DE VELO

Se inocula la levadura en estudio en el tubo de caldo Saboraud y se incuba 1 mes a 21 ºC. Realizar observaciones periódicas.
Anotar los resultados de la siguiente forma:
- Presencia de velo: V
- Presencia de islotes: I
- Presencia de anillo: A
- Ausencia de velo: VN
- Sedimento de levaduras: S
- Fuerte turbidez y desprendimiento de burbujas: T


2.2.- FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

Se inocula una gota de la levadura en estudio a cada uno de los tubos de fermentación de azúcares (glucosa, lactosa, sacarosa). Se incuba a 28 º C durante 15 días. Si la prueba es positiva y existe fermentación se forma gas que será recogido en la campana Durham.


2.3.- ASIMILACIÓN DE NITRATOS

La inoculación se realiza a partir de una suspensión de la levadura en agua destilada estéril en un tubo de asimilación de nitratos y en el medio paralelo. Se incuban 15 días a 28 º c.

Una vez pasado este tiempo, se comparan los dos cultivos pertenecientes al mismo microorganismo  y se observa si la presencia de nitrato potásico ha facilitado, o no, el crecimiento de la cepa de estudio.

- Resultado positivo: Cuando el crecimiento es mayor en el medio con nitratos.
- Resultado negativo: Cuando no existe diferencia de crecimiento.

Son pocas las especies de levaduras que asimilan nitratos lo que significa que la mayor parte de las levaduras no están capacitadas para metabolizar el nitrógeno en su forma química más estable. No pueden movilizarlo de este compuesto químico para ser utilizado como fuente de nitrógeno en sus procesos anabólicos de biosíntesis.


2.4.- DESARROLLO EN PRESENCIA DE ETANOL

Inocular el medio de etanol con una gota de suspensión de levadura. Mantener el cultivo a 27ºC durante 30 días. Anotar la posible existencia de crecimiento celular y formación de velo.


2.5.- FORMACIÓN DE ESPORAS

Sembrar las cepas problema en una placa de agar Gorodkova  que favorece la formación de las mismas. Se observarán al microscopio con una tinción diferencial  “tinción de esporas”.

Método:
A partir de un cultivo de levaduras en Agar gorodkowa, preparamos un frotis fijado con calor .
- Sujetamos la preparación con las pinzas de madera y cubrimos con verde malaquita.
- Calentamos la preparación ligeramente sobre la llama hasta que el colorante emita un vapor tenue pero evitando la ebullición.
- Continuamos calentando 5 minutos más en las mismas condiciones, reponemos colorante si se evapora excesivamente.
- Enfriar la preparación y lavar con agua del grifo.
- Cubrir la preparación con safranina, mantener 1 minutos y lavar el exceso de colorante con agua.
- Observar la preparación al microscopio, las esporas se teñirán de verde y las células de rojo/rosa.


2.6.- FORMACIÓN DE RAMIFICACIONES PSEUDOMICELIARES

Material:
- Placas Petri
- Papel de filtro
- Tubo de vidrio acodado
- Portas
- Cubreobjetos estériles
- Agar corn-meal Preparar un tubo con 5 ml de agar corn-meal y esterilizar en autoclave (por bancada)
- Agua destilada estéril

Método:
1.- Preparar las placas Petri con papel de filtro, vidrio acodado, porta y esterilizar en autoclave. Esterilizar también los cubreobjetos.
2.- Poner a fundir el tubo de agar corn-meal y dejar atemperar a 45-50 ºC. Con ayuda de una pipeta estéril extender unas gotas  del medio fundido en el porta estéril situado sobre el vidrio acodado en U, colocado a su vez en la placa Petri estéril (el porta admite un volumen de 1 ml de medio).
3.- Transferir con un asa de cultivo tipo “aguja” la levadura problema realizando varias estrías en el agar.
4.- Colocar el cubre con pinzas estériles, de tal forma que la mitad de las estrías queden cubiertas por el porta y la mitad al descubierto.
5.- Añadir suficiente agua destilada sobre el papel de filtro para mantener la humedad del ambiente en la placa Petri.
6.- Incubar a 25 ºC durante 15 días y examinar microscópicamente. Vigilar que la placa no se reseque.


PREPARAR MEDIOS DE CULTIVO PARA IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

MEDIO DE FERMENTACIÓN DE AZUCARES (GLUCOSA)
Preparar 250 ml, repartir a razón de 10 ml por tubo, introducir una campana Durham y autoclavar.
- Yeast. Nitrógeno base: 6.7 gr/l
- Azúcar: 20gr/l
- Agua: 1l

MEDIO DE FERMENTACIÓN DE AZUCARES (SACAROSA)
Se procede como en el caso anterior, cambiando el tipo de azúcar.

MEDIO DE FERMENTACIÓN DE AZUCARES (LACTOSA)
Se procede como en el caso anterior, cambiando el tipo de azúcar.

MEDIOS DE ASIMILACIÓN DE NITRATOS

MEDIO 1 CON NITRATO Y MEDIO PARALELO SIN NITRATOS.
Preparar 150 ml, de medio 1 y de medio paralelo, disolver, distribuir en tubos a razón de 5 ml, autoclavar y enfriar en slant.


Medio 1:
- Yeast carbón base: 11,7 gr/l
- Nitrato de potasio: 0,78 gr/l
- Agar: 20gr/l
- Agua: 1l

Medio Paralelo:
- Yeast carbón base: 11,7 gr/l
- Agar: 20gr/l
- Agua: 1l

Medio de Etanol:
Preparar 150 ml, de medio distribuir en tubos a razón de 5 ml, autoclavar y añadir etanol a razón de 3%.
- Yeast Nitrogeno base: 0.67 gr
- Agua: 100 ml

Medio de Formación de Velo:
Preparar 250 ml de caldo Saboraud, repartir a razón de 10 ml por tubo y autoclavar.

Medio par Observar Pseudomicelio:
- Preparar agar cornmeal, medio comercial preparado, para observar pseudomicelios en las levaduras.
- Preparar 100 ml distribuir en tubos a razón de 5 ml y autoclavar.

Medio de Formación de Esporas. Agar Gorodkova

Composición de Agar Gorodkova:
- 1 l de agua
- 5 gr de peptona
- 2,5 gr de glucosa
- 5 gr NaCl
- 10 gr de extracto de carne
- 20 gr de agar 

2 comentarios:

  1. hola, buen blog en realidad ayudas muchisimo con los temas que tratas, una pregunta podrias decirme cual es la concentracion de levaduras por ml durante la fase inicial, de fermentación y final (producto terminado)?

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    1. - Si utilizamos Levadura Inoculada: Aunque existen muchas especies de levaduras, Saccharomyces Cerevisiae, es la más importante en la elaboración de vinos de calidad.

      Según el fabricante 106 - 107 ufc/ml de Saccharomyces cerevisiae (Es decir entre un millón y diez millones, en unidad formadora de colonias por ml). La dosis del fabricante suelen ser de entre 20 y 40 gr/Hl (es decir por cada 100 litros).

      Destacar que en 1 ml de mosto no cave más de 108 ufc/ml (es decir 100 millones), dicho esto el objetivo de la adición de levaduras es saturar el medio y que no entre nada más de lo que nosotros hemos adicionado, que es la levadura que nos interesa por sus características, etc.

      - Si no inoculamos: En las fermentaciones espontáneas, la variación es más grande.

      Si se han realizado tratamientos antibotrytis en la uva, la población será prácticamente nula, ya que las levaduras son hongos al igual que la botrytis cinerea.

      Si las uvas están en buen estado y no se ha efectuado tratamiento antifúngico alguno. La población de levaduras oscilara entre 102 – 103 ufc/ml (es decir entre 100 y 1000), pero realmente Saccharomyces cerevisiae será cómo mucho de 10 ufc/ml. Por que en la naturaleza hay muchos tipos de levadura y Saccharomyces representa solo una pequeña parte de ellas.

      Durante el transcurso de la fermentación, debido a la adición de anhídrido sulfuroso, la ausencia de oxigeno y la presencia de alcohol al final de la fermentación la presencia de Saccharomyces cerevisiae será de alrededor de 106 - 107 ufc/ml.

      A partir de que no queden azúcares y debido a la ausencia de nutrientes, la población empezara a decaer hasta extinguirse. Quedando únicamente formas de resistencia o esporas, que en condiciones favorables volverán a generar individuos o levaduras viables.

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