jueves, 25 de junio de 2015

Recuento de Levaduras Brettanomyces en el Vino



RECUENTO DE LEVADURAS BRETTAMOMYCES EN EL VINO

Brettanomyces (o dekkera): Es un género de levaduras muy resistente a altas concentraciones alcohólicas que puede desarrollarse en los vinos, aunque muy sensibles a los tratamientos con anhídrido sulfuroso.

Estos hongos o levaduras suelen anidar en barricas usadas donde son más difíciles de eliminar, y son capaces de producir etil-fenoles, que confieren olores cara tarísticos a los vinos: que recuerdan a cuada, caballo, animal, plásico, queso rancio, etc.

Caractarísticas:
- Morfológicamente son muy variables.
- Tiene una actividad fermentativa baja y es de crecimiento lento.
- Muy sensible al sulfuroso.
- Puede desarrollarse en condiciones aerobias y anaerobias. En presencia de aire, aumenta la acidez volátil.
- Utiliza como fuente de C, azúcares residuales, (300mg/l son suficientes). Los vinos de mayor º tienen más riesgo porque  presentan más azúcares residuales.
- Utiliza etanol, es resistente al etanol.
- El mayor riesgo de contaminación es en barrica, tras la FOH y la FML.
- Resistente a cicloheximida (actidiona).


Consecuencias del Desarrollo en un Vino de Bretanomyces:
- Transforma los ácidos hidroxicinámicos (p- cumárico) en vinilfenoles y estos son reducidos por acción de la vinilfenolreductasa en etilfenoles.

Por encima de 1000 UFc/ml la calidad organoléptica del vino está seriamente comprometida.
- Aumenta la acidez volátil.
- Produce tetrahidropiridinas causantes del “Olor a ratón”.
- Produce Aminas biógenas.

Tratamientos de Vinos Contaminados:
. Siempre limpieza y desinfección energica de las barricas
- Si no se detecta los etilfenoles:
. Parar el crecimiento de Bretanomyces con un sulfitado.
- Si se detectan etilfenoles (se manifiesta sensorialmente la alteración):
. Tratamiento con agentes desodorizantes (carbón activo).
. También está indicado la clarificación y posterior filtración del vino


METODO 1

Para el método 1 y 2 se va a utilizar un medio de cultivo específico, ya preparado, para brettamomyces.

Este medio contiene, entre otros:
- Inhibidores del crecimiento de hongos.
- “Cicloheximida”, antibiótico que inhibe el desarrollo de Sacharomyces.
- Acido p-cumárico, precursor de los etil-fenoles, responsables del “olor a brett”.
- Indicador de color para la acidez,(verde de bromocresol) si aumenta la acidez el color del medio va a virar de azul a amarillo.
- Etanol como fuente de carbono

Procedimiento:
- Tomar 10 ml de la muestra de vino bien homogenizada  en un tubo Falcon estéril (tubo para la centrifuga).
- Centrifugar a 3.500 rpm durante 10 minutos
- Tirar el sobrenadante y resuspender el Pellet en 1 ml de solución salina (0,9%)
- Sembrar 100 µlitros en las placas con el medio específico de brettanomyces, extender con un asa de drigalski triangular

Incubar a 30 ºC,  durante 7 días. (Microorganismo de crecimiento lento).

El resultado se considera positivo cuando el medio reúne las condiciones siguientes: aparición de colonias amarillentas tras 5 días o más, cambio de color del medio de azul a amarillo y aparición del aroma fenolado característico de “brett”. Debido al lento crecimiento la aparición de estas características puede demorarse entre 10 y 14 días.

En el caso de que el cultivo de positivo, para asegurar que se trata de brettanomyces, es necesario realizar una extracción de DNA y  realizar una identificación genética por PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

UFC/ml= nº colonias/  ml


METODO 2. FILTRACIÓN

1. Filtrar de 100 a 150 ml de muestra a través de una membrana utilizando el sistema de filtración.
2. Tras la filtración, colocar la membrana sobre el agar de forma que quede uniformemente adherida al medio.
3. Examinar las placas durante 10-14 días de incubación a 25º- 30º C


METODO 3. SNIFF BRETT

Es un medio líquido para detectar el nivel de población de Brettanomyces. Por su bajo coste y su simplicidad permite a una bodega equipada con un pequeño laboratorio enológico estimar el nivel de contaminación en Brettanomyces, sin necesidad de métodos microbiológicos muy desarrollados.


1. Tomamos 25 ml de vino de la barrica con pipeta estéril
2. Adicionamos los 25 ml de vino cuidadosamente al medio líquido de snifbrett
3. Ponemos a incubar a 25 ºC.

En este caso se estudian los resultados siguiendo el siguiente protocolo:
Lectura a los 2 días, a los 4 a los 6 a los 8 y a los 10 días
1) Observar si el vino está turbio o no.
2) Oler: Puede notarse un olor a vino mezclado con un olor a caldo hervido (proveniente del medio de cultivo). Pero si hay Brett que produce etil- fenoles  el olor es muy característico. La diferencia entre los dos olores es espectacular.


CONTROL DE MICROORGANISMOS EN VINO. CONTROL DE EMBOTELLADO FILTROS DE MEMBRANA.

- Fundamento: Después del embotellado, el vino está generalmente exento de microorganismos, o tiene un número muy bajo que no compromete su conservación.
La eficacia del filtrado por membrana, del sistema de esterilización de botellas… que en definitiva generarán ausencia de microorganismos, se puede verificar  pasando un volumen conocido de vino  a través de un filtro que retenga los microorganismos presentes e incubando posteriormente este filtro  en un medio de cultivo específico (a veces el propio filtro va impregnado del medio de cultivo).

- Material: Equipo de filtración; Bomba de vacío; Placas y membranas con los medio adecuados; Pinzas; Vino para filtrar.

Método:
- El equipo de filtración debe esterilizarse antes de ser  usado ( aquellas partes que contactan con el vino antes de ser filtrado)
- Conectar la bomba de vacío
- Colocar la membrana filtrante en su lugar, usando unas pinzas estériles.
- Colocar el embudo
- Verter la muestra a filtrar (un volumen adecuado) sobre el embudo
- Separar la membrana y colocarla en una placa.
- Incubar las placas en estufa a 25ºC.




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