domingo, 2 de enero de 2011

Determinación de Antocianos en el Vino



DETERMINACIÓN DE ANTOCIANOS EN EL VINO (Practicas Laboratorio)

MÉTODO DE DECOLORACIÓN POR EL SULFUROSO (MÉTODO DE RIBEREAU-GAYÓN)
Método de Decoloración por el sulfuroso o Método de Ribereau-Gayón

Fundamento:
Los iones bisulfito (SO3H-) se combinan con los antocianos produciendo un compuesto incoloro. La reacción se produce en medio ácido para evitar la interferencia del ac. sulfuroso agregado al vino y también la modificación de la materia colorante por formación de complejos con los metales. En estas condiciones la disminución del color es proporcional a la concentración de antocianos.

Reactivos:
- Alcohol ácido al 0,1% con CIH. Se prepara añadiendo o,1 ml. de CIH concentrado y enrasando hasta 100ml. con alcohol etílico de 95 - 96º
- CIH al 2%. Se prepara con 2ml. de CIH concentrado y enrasando hasta 100ml. con agua destilada.
- Bisulfito sódico al 15%. Se puede presentar de diferentes modos:
. Con 15 gr. de SO3HNa enrasando a 100ml. con agua destilada. Esta disolución hay que prepararla cada día.
. Se prepara una dilución de SO3HNa con densidad = 1,24 diluida a 1/2. También cada día.
. Se puede hacer también con Metabisulfito potásico al 15%. Para ello si consideramos el Metabisulfito con una riqueza del 55%, los prepararíamos tomando 27,27 gr. de Metabisulfito K y completando hasta 100ml. con agua destilada. Solución muy inestable que también hay que preparar cada día.

Procedimientos:
En un tubo de ensayo mezclamos:
- 1ml. de vino (En vinos con mucho color se necesita diluir 1/5, 1/10).
- 1ml. de Alcohol ácido. (Estabiliza el color).
- 20ml. de HCI al 2%

Se distribuye en dos tubos de ensayo:
Tubo 1
- 10 ml. de tubo anterior.
- 4ml. de sol. de bisulfito.
Tubo2
- 10 ml. de idem.
- 4 ml. de agua destilada.

Se cierran los dos tubos, el tubo con la solución de bisulfito debe de estar perfectamente cerrado.
Agitamos los dos tubos esperamos 20 minutos a que se estabilice la reacción.
Medimos la absorvancia a 520 nm. en una cubeta de 1cm. Hacemos el cero con agua destilada.

Cálculos:

D.O. = D.O. tubo 2 (agua) - D.O. tubo 1 (decolorado)

Si esta diferencia está entre 0,43 y 0,04 lo consideramos un valor válido, si la diferencia es superior tendremos que diluir, y el resultado final habrá que multiplicarlo por la dilución.

Antocianos (mg/l) = D.O: x 870 (Otros autores consideran 875)

MÉTODO POR DIFERENCIA DE pH (STONESTREET)
Método por diferencia de pH (stonestreet)

Fundamento:
La acidificación de un vino tinto provoca un aumento de color rojo de los antocianos sin modificar el color de otros compuestos coloreados del vino.
Realizándolo en determinadas condiciones, el aumento del color es proporcional a la concentración de los antocianos.

Reactivos:
- Alcohol ácido al 0,1% con CIH. Se prepara añadiendo o,1 ml. de CIH concentrado y enrasando hasta 100 ml. con alcohol de 96 - 96º
- CIH al 2%. (pH = 0,6). Se prepara con 2 ml. de CIH concentrado y enrasado hasta 100 ml. con agua destilada.
- Solución tampón de pH = 3,5 compuesta de:
. 303,5 ml de fosfato disódico o,2 M (71,63 gr/l).
. 696,5 ml de ácido cítrico 0,1 M (21,05 gr/l).
. 21,74 ml de fosfato disódico + 14,63 gr de ac. cítrico por litro.

Procedimientos:
Utilizamos 2 tubos de ensayo:
Tubo A (pH = 0,6)
- 1 ml. de vino (sin diluir).
- 1 ml. de alcohol ácido al 0,1%
- 10 ml. de sol. tampón 3,5

Tubo B (pH = 3,5)
- 1 ml. de vino (sin diluir).
- 1 ml. de alcohol ácido al 0,1%
- 10 ml. de HCI al 2%

Medimos la absorvancia a 520 en cubeta de 1cm. de espesor. Siendo D.O. = D.OB - D.OA

Calculos:

Podemos comparar la diferencia de D.O. obtenida con una recta patrón que realizaremos en las mismas condiciones, con muestras que oscilen entre 40 y 400 mg/l de antocianos.

En la práctica se utilizan cualquiera de las dos fórmulas siguientes:

Antocianos (mg/l) = D.O. x 400 (Según otros autores se multiplica por 388)

MÉTODO DE PUISANT - LEÓN
Método de Puisant - León

El método se basa en la propiedad que tienen los antocianos de aumentar su color rojo al aumentar la acidez. Es una simplificación del método de diferencia de pH.

Es un método muy extendido por su sencillez, aunque su exactitud y eficacia sea más limitada que en los otros métodos propuestos.

Reactivos:
- HCI al 1% en peso ó 0,84% en volumen

Procedimiento:
Existen dos formas diferentes de hacerlo:

A/ Diluimos 1 ml. de vino HCI al 1% que tenemos preparado, en general será suficiente una dilución 1:10, la dilución será la necesaria para conseguir que la D.O. esté comprendida entre 0,2 - 0,7. Medimos la absorbacia a 520 nm.

B/ Aprovechamos la dilución 1:100 que realiza para hacer el I.P.T. midiendo la D.O. a 280 nm. De esta disolución solo tomamos 2 ó 3 ml. para llenar la cubeta, si tenemos cuidado y no desperdiciamos más, añadimos directamente a la disolución que queda 1 ml. de CIH concentrado y medimos la absorvancia 520 nm. y calculamos los antocianos.

En este caso la dilución que estamos haciendo al vino es de 1:100, por lo que los valores de absorvancia son muy bajos y estamos cometiendo muhco error. Sin embargo tiene la ventaja de su mayor rapidez y sencillez, se puede utilizar con mayor fiabilidad cuando los vinos tienen valores de antocianos superiores a 400 mg/l, que entonces nos darán valores de aborvancia en torno a 0,2 o supriores, por tanto se puede usar en vinos jóvenes, bien dotados de color.

Cálculos:

Se aplica la formula siguiente: Antocianos (mg/l) = D.O. x 22,76 x dilución

Ejemplo:

Mezclamos 1 ml. de vino + 10 ml. de CIH al 1% -- Dilución 1:11 -- Obtenemos un valor de D.O = 0,23

0,23 x 22,76 x 11 = 58 mg/l de Antocianos.

Si aplicásemos el método B, nos daría un valor de D.O. = 0,025 que no es una medida valida en el espectrofotrometro por excesiva dilución, y cometeríamos demasiado error.

Ejemplo:

Vamos a suponer un vino conun contenido en antocianos de 580 mg/l, por ejemplo un vino tinto bien dotado de color en sus inicios. Si le aplicamos los dos métodos nos da:

Método A

D.O. x 22,76 x 11 = 580

D.O. = 2,3 que está fuera de rango de las medidas que podemos considerar válidas en el espectrofotómetro.

Si consideramos una medida valida de 0,7 deberíamos hacer una dilución de:

0,7 x 22,76 x d = 580 dilución 1:36

Método B

Con una dilución de 1:100, nos daría un valor de D.O.

D.O. x 22,76 x 100 = 580

D.O = 0,255, valor aceptado como medida.

Por tanto en este caso sería mas rápido y sencillo utilizar el método B.

De los dos métodos propuestos:
. Decoloración por sulfuroso.
. Método por diferencia de pH.

En el segundo método hay una mayor sensibilidad a la presencia de sulfuroso libre en los vinos por lo que cometemos algo mas error, siendo el método por decoloración con sulfuroso el método mas fiable.

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